细胞换液步骤_范文大全

细胞换液步骤

【范文精选】细胞换液步骤

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【专家解析】细胞换液步骤

【优秀范文】细胞换液步骤

范文一:细胞的换液 投稿:陆竤童

细胞的换液

准备器材:1、完全培养基

2、移液管

步骤:1、用酒精喷洒洁净太,点燃酒精灯。

2、把完全培养基放至室温,然后用酒精喷洒,放入洁净台。

3、从二氧化碳培养箱拿出细胞,至镜下观察。

4、把培养基瓶打开(左手近瓶尾),瓶盖、瓶口在酒精灯上 灭菌。瓶盖可以放的较远,以免阻挡操作。

5、把培养瓶的盖子打开,同上。(培养瓶在灭菌时,只灭一 侧)

6、将移液管的盖子打开一点,仅露出一部分。镊子在酒精灯 上灭菌,用镊子夹起移液管(近棉花部分),套上洗耳球。

7、将移液管插入培养瓶中(在之前摇晃培养瓶),轻按洗耳 球吸出原培养液,至吸净。(注意力度,不要洗到棉球内)

8、将移液管的盖子打开一点,仅露出一部分。镊子在酒精灯 上灭菌,用镊子夹起移液管(近棉花部分),套上洗耳球。

9、在完全培养基内吸取培养液,放到培养瓶内,不要把移液 管伸入培养瓶内,竖直培养瓶,微微倾斜移液管,直接加 入培养液。加至可以平铺培养瓶底部。

10、盖上培养瓶盖子(注意酒精灯上的灭菌)。镜下观察。

11、盖上完全培养基(注意酒精灯上的灭菌)。

12、整理洁净台!

范文二:养细胞步骤 投稿:钱攤攥

一、细胞换液

1、 实验室和超净台紫外线消毒30min

2、 开始实验,关闭紫外线,玻璃板不能超过标记的黄线,打开通风设备

3、 用酒精棉由里向外消毒实验台,再用酒精棉消毒双手,放入超净台的试剂瓶应先用

酒精棉擦拭在放入超净台中

4、 将细胞培养瓶瓶口过火,然后打开再将瓶口和瓶盖过火,如果培养瓶数量过多应将

瓶盖与培养瓶对应以免盖错造成互相感染

5、 倒掉培养瓶中的培养液,瓶口应尽量远离废液缸,以免造成污染

6、 用移液枪吸取5mlPBS,取枪头需用镊子夹取,镊子用之前过火,只夹取枪头尾部,

然后用手拿出,注意手只能碰枪头尾部的头部,枪头不能接触超净台,用移液枪吸取PBS时应该将枪头的头部过火,移液枪的枪头不能碰到试剂瓶,进行操作时注意胳膊不应放到培养瓶上方

7、 将PBS注入到培养瓶中,应将移液枪中的液体打到没有细胞的那一面

8、 将培养瓶放倒轻轻晃动,洗去培养瓶细胞面的死细胞以及细胞的代谢产物,倒掉PBS

9、 换取另一个新的枪头,吸取培养液打入到培养瓶中,将培养瓶与瓶盖过火,盖好,

如果多个培养瓶枪头不碰到瓶壁,则不用更换枪头,否则需要更换枪头

10、 放入培养箱中,瓶盖应该拧松,与外界空气想通

注意事项:1、进入超净台的试剂瓶应消毒

2、使用的器械应该进行过火

3、试剂瓶应该过火之后打开,盖上之前也应该过火

4、注意胳膊不能放到培养瓶口的上方

5、倒废液时瓶口远离废液缸

6、拿出的培养瓶应该拧紧,放入培养箱的培养瓶应将瓶盖拧松使之与外界

空气想通

7、所用试剂在使用前应该预热

二、细胞传代

1、 将培养瓶拿到超净台中,倒掉培养液

2、 加入PBS冲洗坏死的细胞以及细胞代谢产物

3、 加入胰酶溶解细胞,加入胰酶后放入培养箱中,一段时间后可用显微镜看到细胞变

圆,从培养瓶上脱落下来,形成一层白膜

4、 加入培养液反复吹打,使细胞从培养瓶上脱落,吹打应该尽量减少泡沫的产生,以

免导致细胞的机械性损伤

5、 将培养瓶中的液体移到试管中,进行离心

6、 离心后出现细胞沉淀,弃掉上层液体,重新加入培养液,然后反复吹打使细胞混匀

7、 将混匀的细胞加到培养瓶中,在将细胞以及培养液导入的培养瓶时,移液枪应朝向

细胞不生长的那一面将细胞与培养液导入到培养瓶中

范文三:细胞转染的步骤 投稿:曾鏆鏇

【试剂与仪器】

1 .小牛血清。

2 .双抗溶液(链霉素 100μg+ 青霉素 100 单位)。

3 . DMEM 培养基。

4 .转染试剂( LIPOFECTAMINE 2000 )。

5 .细胞培养基( DMEM+10%NCS )。

6 . PBS 。

7 .无血清培养基。

8 .胰酶( Trypsin )。

9 .培养皿,移液管,量筒,恒温水浴箱,离心机, 15ml 离心管,微量移液器,荧光显微镜和 CCD 。

【操作步骤】

1 .转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板,使其在转染日密度为 90% 。细胞铺板在 0.5ml 含血清,不含抗生素的正常生长的培养基中。

2. 对于每孔细胞,使用 50μl 无血清 DMEM 培养基稀释 0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。

3. 对于每孔细胞,使用 50μl DMEM 培养基稀释 1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。 LIPOFECTAMINE 2000 稀释后,在 5 分钟内同稀释的 DNA 混合。保温时间过长会降低活性。

4. 混合稀释的 DNA (由第 2 步)和稀释的 LIPOFECTAMINE 2000 (由第 3 步)。在室温保温 20 分钟。注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。复合物可以在室温保持 6 小时稳定。

5. 直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。注意:如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,替换为 0.5ml 无血清培养基。

6. 在 37℃ , 5 %的 CO 2 中保温 24-48 小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在 4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。

7. 在细胞中加入复合物 24-72 小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

范文四:细胞复苏的步骤 投稿:苏砗砘

细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作,可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。细胞的原代培养和传代培养以及细胞冻存和复苏后都需要细胞计数。

一、细胞冷冻保存

1、材料:

生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO (Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene

5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)

2、冷冻保存方法:

(1)传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16~18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。

-20℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

3、步骤:

(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。

(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜 (DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。

(3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

(4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。

4、注意事项:

(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。

(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。

(4)冷冻保存之细胞浓度:

①normal human fibroblast:1~3×106cells/ml

②hybridoma:1~3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

③adherent tumor lines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ml

④other suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte须至少5×106cells/ml。

(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败。

(6)冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞

悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80%~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。

二、冷冻细胞活化

1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。

2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。

3、材料

37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器

4、步骤:

(1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。

(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。

(3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。

(4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。

(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15),混合均匀,放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。

(7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。

三、细胞计数与存活测试

1、原理:

(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。

(3)存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料,如果细胞不易吸收trypan blue,则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。

2、材料:

0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin

bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于

100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。

3、步骤:

(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

注:4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml 计数板计数时,最适浓度为5~10×105细胞/ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。

5、范例:

T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液,取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格:55,62,49,59;死细胞数/方格:5,3,4,6;细胞总数=243

平均细胞数/方格=60.75;稀释倍数=2;

细胞数/ml:60.75×104×2(稀释倍数)=1.22×106;

细胞数/flask(10ml):1.22×106×10ml=12.2×106

存活率:225/243﹦92.6%

在细胞复苏过程中经历多次复苏失败,最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复苏成功,上述是个人总结的细胞冻存复苏及细胞计数的操作程序和注意事项,望能为各位同学提供些参考。

范文五:细胞复苏的步骤 投稿:莫喊喋

主要器材:一次性滴管、打火机、酒精灯、大镊子、中镊子、记号笔、废液缸、封口膜、剪子。

主要试剂: PBS、培养液、消化酶(胰酶)、75%酒精、双抗。 PBS配制:NaCL :4g KCL:0.1g Na2HPO4 :1.745g KH2PO4 :0.1g

三蒸水:500mL,溶解后高压灭菌。

培养基配制:5mL双抗、50mL血清,加入培养基中。

细胞复苏步骤:

1、 水浴锅打开,调到35.8°C~37°C。

2、 打开超净台,放入主要用具,开紫外灭菌30min。(主要器具包

含:镊子、离心管、酒精灯、封口膜、一次性滴管、培养瓶、废液缸。)

3、 将培养液带入细胞间,瓶上喷酒精,放入超净台,过火,撕封口

膜,过火灭菌。

4、 用滴管取3ml培养液放入离心管中。

5、 从液氮中取出螺口瓶,放入之前开好的水浴锅中迅速融化。

6、 快速去细胞间,喷洒酒精灭菌,开盖,将细胞吸出放入离心管中,

1000转离心5min。

7、 培养瓶中加入5ml培养液,过火灭菌。

8、 取出离心管,倒掉培养液,用滴管取1ml培养液冲洗离心好的细

胞,移到培养瓶中,轻轻摇匀,显微镜下观察。

喷酒精灭菌,放入孵育箱中。整理超净台。

范文六:流式细胞仪步骤 投稿:钱瓄瓅

流式细胞术分析细胞周期时相 实验原理:流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中,在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出,形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测,得到该细胞的光散射和荧光指标,分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。

细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化,如G0/G1期的DNA含量为2C,而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法,通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定,可分析细胞周期各时相的百分比。 仪器:流式细胞仪,细胞培养设备,离心机,水浴,冰箱

材料:HeLa细胞,5ml注射器,离心管,封口膜,微量移液器,Tips

试剂:70%乙醇(保存于4℃),RNase-A (10mg/ml,-20℃保存),

PI (650µg/ml,避光保存于-20℃),PBS(pH 7.4,保存于4℃)

实验步骤:

取对数生长期细胞,倒去培养液,胰酶适度消化细胞,用培养液吹打,800rpm , 离心 15 min去上清。

•PBS洗2次,加0.5mL PBS吹匀,务必吹散。

•用5mL注射器将细胞吸起,用力打入5mL 70%(预冷)乙醇中,封口膜封口。4℃固定过夜(可长至2周)

•800rpm 15min收集固定细胞,PBS洗2次

•用0.4mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打(防止细胞破碎)

•加RNase-A约3µL至终浓度约为50µg/mL ,37℃水浴消化30 min;

•加PI约50µL至终浓度约为65µg/mL ,在冰浴中避光染色30 min。

•用300目(孔径40~50微米)尼龙网过滤,上机检测

范文七:细胞转染的步骤 投稿:戴騧騨

转染 B 添加义项

?

DNA小片段插入体细胞或细胞系的过程。若此DNA未与宿主细胞DNA整合而获表达,称“瞬时转染(transient transfection)”;若与宿主细胞DNA整合并随后者的复制而复制称“稳定转染(stable transfection)”。

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本词条 正文缺少必要目录或最新动态, 欢迎各位 编辑词条,额外获取10个积分。 基本信息

中文名称 转染 

外文名称

transfection  

过程

真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。

瞬时转染 transient transfection  

稳定转染

stable transfection

目录

展开

基本简介

标志的过程。

常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用

到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等。

相关分类

化学转染法

包括:1.DEAE-葡聚糖法,2.磷酸钙法,3.人工脂质体法。DEAE-葡聚糖是最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一,DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物,它与带负电的核酸结合后接近细胞

的研究,但用于稳定转染却不是十分可靠。磷酸钙法是磷酸钙共沉淀转染法,因为试剂易取得,价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究,先将DNA和氯化钙混合,然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀,最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上,通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA免受降解.人工脂质体法采用阳离子脂质体,具有较高的转染效率,不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系,而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA,以及RNA,和蛋白质.此外,脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达,与以往不同的是脂质体还可以介导DNA和RNA转入动物和人的体内用于基因治疗。人工合成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成复合物,当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质,随后DNA复合物被释放进入细胞核内,至于DNA是如何穿过核膜的,其机理目前还不十分清楚.

物理方法

包括:①显微注射②电穿孔③基因枪等,显微注射虽然费力,但是非常有效的将核酸导入细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物,但却不适用于需要大量转染细胞的研究。电穿孔法常用来转染如植物原生质体这样的常规方法不容易转染的细胞。电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关系,基因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内,这种方法适用于培养的细胞核在体的细胞.

相关实验

实验目的

色准备实验材料。 实验原理 外源基因进入细胞主要有四种方法:电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入;磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞;病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大;病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响;所以现在对于很多普通细胞系,一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性,因此脂质体与质粒的比例,细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题,通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂,它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物,是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。" 实验材料

(1)材料

293T细胞、MyoD表达质粒和EGFP表达质粒、DMEM培养基、链霉素/青霉素(双抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸盐缓冲溶液)、胰酶/EDTA消化液、转染试剂(TransFast)

(2)器材

20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头酒精灯、废液缸、血球计数板、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、35mm培养皿、转染管、15ml离心管、观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD

实验步骤

细胞传代

(1)试验准备:200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。

转染

(3)用Tip头加入1mlTrypsin液,消化1分钟(37。C,5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。

(5)用Tip头多次吹吸,使细胞完全分散开。

(6)将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。

(7)用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。

(8)将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培养皿中,使其均匀分布。

(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养,第二天转染。

细胞转染

1)转染试剂的准备

A.将400ul去核酸酶水加入管中,震荡10秒钟,溶解脂状物。

B.震荡后将试剂放在-20摄氏度保存,使用前还需震荡,。

2)选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。

5)将混合液在室温放置10—15分钟。

6)吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。

7)加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。

8)到时后,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养24-48小时。

第二次细胞传代

1) 在转染后24小时,观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

2) 再次进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。

3) 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

研究进展

转染技术

物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)的转染性能最佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低。大量实验证明,PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时,PEI经常做为核心组成成分。

转染效率

线型PEI(LinePEI,LPEI)与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI

(BranchedPEI,BPEI)要早一些,过去的研究认为在不考虑具体条件,LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低,有利于细胞定位,因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物,从而提高转染效率,但同时细胞毒性

也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基,在染实验中发现这种PEI的毒性低,但转染效率却较高。

GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联,合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性,因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒,从而提高转染效率,当所形成复合物进入细胞以后,其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解,使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI,这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性,其可降解性对体内应用也具有重要的意义。

范文八:细胞传代步骤 投稿:丁銫銬

细胞传代步骤以(HepG2.215细胞为例)

1、 弃去原细胞培养液,可直接倒活用吸管移除;

2、 适量(约2mL)PBS洗涤2遍;

3、 消化:75 molc㎡培养瓶加2mL胰酶,25 c㎡培养瓶加1mL胰

酶消化,放到37℃孵箱3-5min;

4、 待细胞消化完毕后加含血清的培养基终止消化,75 c㎡培养瓶

加10-12mL,25 c㎡培养瓶加5-6mL,吹打细胞约60次,使细胞成单个;

5、 留下1/3的培养基,弃去2/培养基,尽量把气泡吸干净,再补

加培养基75 c㎡培养瓶补加至12mL,25 c㎡培养瓶补加至6mL;

6、 显微镜下观察细胞形态,置入孵箱中继续培养,每3天传代一

次。

范文九:细胞传代步骤 投稿:程妡妢

1.紫外线提前20-30min打开;

2.关紫外灯,开灯,通气,点燃酒精灯;

3.检查细胞生长状况;显微镜下观察各浓度下细胞生长状况(数量、形态、透. 亮度、贴壁情况);用酒精棉对培养瓶外部进行擦拭。

4.将培养基倒掉,加PBS冲洗一下,如不需传代,加入5ml新鲜培养基即可;

5.传代:加1.5ml 0.1%Trp PBS冲洗一下(快速);

6.加入3滴左右0.1%Trp PBS,37℃1分钟,轻敲瓶壁使大部分细胞脱落,加入3n(n为传代瓶数)ml培养基(DMEM);

7.用吸管轻柔吹打,尽量让细胞均匀分散开来,各取出3ml至新瓶中;

8 .放入CO2培养箱(培养条件5% CO2、饱和湿度、37℃ )

范文十:细胞转染步骤 投稿:沈乐乑

细胞转染及其筛选

1. 传代:细胞于10cm盘消化后接种于6cm盘

向6cm盘中加入3ml培养基,“米”字形摇晃。当细胞生长到50%-70%时,根据细胞的生长速度可进行转染

2. 配置转染体系:(6cm盘)

2.4ug基因载体质粒;9ul转染试剂;200ul无血清培养基。混匀后室温静置10-15min孵育。

3. 将6cm盘中的旧培养基弃去,换新的培养基3ml。

4. 将配置好的转染体系加入到6cm盘中,混匀6-18h内换液。

5. 12小时,换液后进行显微镜拍照观察。

6. 再过6h加入G418,进行筛选(始终在6cm盘中进行),使用G418浓度:600µg/ml

G418的配置:取1gG418溶于1mlHEPES液中,加蒸馏水至10ml,过滤消毒4℃保存。

7. 3-5天换液一次(换液不用PBS冲洗),此时仍要加G418,浓度不变,只到细胞呈单

个细胞那种,当细胞死的过多时,可考虑药物浓度减半。筛选出稳定表达的cell。

8. 挑克隆:1制备细胞悬液,细胞计数,用培养基稀释细胞到1个/10ul,在96孔板中加

入培养基150ul/孔,在加入细胞悬液10ul/孔,待其逐渐增多后转入24孔板、6孔板、6cm盘增殖。

2.伴随着细胞的生长,可能最后会变成细胞簇,故可以用黄枪头把细胞菌落挑出,放入24孔板里面。

9. 单克隆鉴定:提取细胞RNA后,进行RT-PCR检测其表达量。

10. 先做RT-PCR筛选一部分,在做western继续筛选一部分。

所需物品:1.转染试剂(Attractene Transfection Regent);2.96孔板;3.24孔板;4.6孔板;5.6cm盘;6.G4187. 1mlHEPES液

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