细胞换液步骤_范文大全

细胞换液步骤

【范文精选】细胞换液步骤

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【专家解析】细胞换液步骤

【优秀范文】细胞换液步骤

范文一:细胞的换液 投稿:陆竤童

细胞的换液

准备器材:1、完全培养基

2、移液管

步骤:1、用酒精喷洒洁净太,点燃酒精灯。

2、把完全培养基放至室温,然后用酒精喷洒,放入洁净台。

3、从二氧化碳培养箱拿出细胞,至镜下观察。

4、把培养基瓶打开(左手近瓶尾),瓶盖、瓶口在酒精灯上 灭菌。瓶盖可以放的较远,以免阻挡操作。

5、把培养瓶的盖子打开,同上。(培养瓶在灭菌时,只灭一 侧)

6、将移液管的盖子打开一点,仅露出一部分。镊子在酒精灯 上灭菌,用镊子夹起移液管(近棉花部分),套上洗耳球。

7、将移液管插入培养瓶中(在之前摇晃培养瓶),轻按洗耳 球吸出原培养液,至吸净。(注意力度,不要洗到棉球内)

8、将移液管的盖子打开一点,仅露出一部分。镊子在酒精灯 上灭菌,用镊子夹起移液管(近棉花部分),套上洗耳球。

9、在完全培养基内吸取培养液,放到培养瓶内,不要把移液 管伸入培养瓶内,竖直培养瓶,微微倾斜移液管,直接加 入培养液。加至可以平铺培养瓶底部。

10、盖上培养瓶盖子(注意酒精灯上的灭菌)。镜下观察。

11、盖上完全培养基(注意酒精灯上的灭菌)。

12、整理洁净台!

范文二:养细胞步骤 投稿:钱攤攥

一、细胞换液

1、 实验室和超净台紫外线消毒30min

2、 开始实验,关闭紫外线,玻璃板不能超过标记的黄线,打开通风设备

3、 用酒精棉由里向外消毒实验台,再用酒精棉消毒双手,放入超净台的试剂瓶应先用

酒精棉擦拭在放入超净台中

4、 将细胞培养瓶瓶口过火,然后打开再将瓶口和瓶盖过火,如果培养瓶数量过多应将

瓶盖与培养瓶对应以免盖错造成互相感染

5、 倒掉培养瓶中的培养液,瓶口应尽量远离废液缸,以免造成污染

6、 用移液枪吸取5mlPBS,取枪头需用镊子夹取,镊子用之前过火,只夹取枪头尾部,

然后用手拿出,注意手只能碰枪头尾部的头部,枪头不能接触超净台,用移液枪吸取PBS时应该将枪头的头部过火,移液枪的枪头不能碰到试剂瓶,进行操作时注意胳膊不应放到培养瓶上方

7、 将PBS注入到培养瓶中,应将移液枪中的液体打到没有细胞的那一面

8、 将培养瓶放倒轻轻晃动,洗去培养瓶细胞面的死细胞以及细胞的代谢产物,倒掉PBS

9、 换取另一个新的枪头,吸取培养液打入到培养瓶中,将培养瓶与瓶盖过火,盖好,

如果多个培养瓶枪头不碰到瓶壁,则不用更换枪头,否则需要更换枪头

10、 放入培养箱中,瓶盖应该拧松,与外界空气想通

注意事项:1、进入超净台的试剂瓶应消毒

2、使用的器械应该进行过火

3、试剂瓶应该过火之后打开,盖上之前也应该过火

4、注意胳膊不能放到培养瓶口的上方

5、倒废液时瓶口远离废液缸

6、拿出的培养瓶应该拧紧,放入培养箱的培养瓶应将瓶盖拧松使之与外界

空气想通

7、所用试剂在使用前应该预热

二、细胞传代

1、 将培养瓶拿到超净台中,倒掉培养液

2、 加入PBS冲洗坏死的细胞以及细胞代谢产物

3、 加入胰酶溶解细胞,加入胰酶后放入培养箱中,一段时间后可用显微镜看到细胞变

圆,从培养瓶上脱落下来,形成一层白膜

4、 加入培养液反复吹打,使细胞从培养瓶上脱落,吹打应该尽量减少泡沫的产生,以

免导致细胞的机械性损伤

5、 将培养瓶中的液体移到试管中,进行离心

6、 离心后出现细胞沉淀,弃掉上层液体,重新加入培养液,然后反复吹打使细胞混匀

7、 将混匀的细胞加到培养瓶中,在将细胞以及培养液导入的培养瓶时,移液枪应朝向

细胞不生长的那一面将细胞与培养液导入到培养瓶中

范文三:流式细胞术步骤 投稿:侯檅檆

利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡

1. 细胞按每孔4×105 个的密度接种于60 mm细胞培养皿内,培养过夜后,用相应药物处

理细胞。

(设置实验组和对照组,实验组依辛伐他汀浓度分为3组,2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L辛伐他汀组

正常对照组(NC组):胰岛素终浓度0.058mg/L

A组:辛伐他汀终浓度2μmol/L+胰岛素终浓度 0.058mg/L; B组:辛伐他汀终浓度5μmol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L; C组:辛伐他汀终浓度10μmol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L; 于37℃,5%CO2培养箱中孵育48h)

2. 胰酶消化收集细胞,并用1 mL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次,全部加入15ML管中。 3. 800 rpm离心5分钟,去除上清,加5 mL PBS缓冲液重悬细胞,再次离心弃上清,重复

两次,最后重悬细胞于0.5mL PBS中。

4. 用低速振荡器边震动边加入5 mL预冷的70%乙醇,固定,4℃过夜。

5. 次日将固定好的细胞以1000 rpm的转速离心5分钟,弃上清,加入4 mL PBS清洗一次,

用0.4 mL PBS重悬细胞。

6. 加入5 μL RNaseA(10 mg/ml)37℃消化1小时,加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶(propidium

iodide PI)4℃避光染色过夜(或者37℃避光染色1小时),在EPICS XL流式细胞仪上分析。

利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化

1. 细胞按每孔4×105 个的密度接种于60 mm细胞培养皿内,培养过夜后,用相应药物处

理细胞。

2.胰酶消化收集细胞,并用1 mL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次,全部加入15ML管中。 3 . 800 rpm离心5分钟,去除上清,加5 mL PBS缓冲液重悬细胞,再次离心弃上清,重复两次,最后重悬细胞于0.1mL PBS中,并转移到1.5 mL离心管中。

4. 按照1:100加入1UL一抗(如下图对应),置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。 5. 1500rpm,小型离心机离心5分钟,去除上清,加1 mL PBS缓冲液重悬细胞,再次离心弃上清,重复3次,最后将洗好的细胞重悬于0.1mL PBS中。

6.分别将荧光二抗DyLight 488、DyLight 567按照1:100比例加入细胞悬液中,室温孵育1小时。

7. 1500rpm离心5分钟,去除上清,加1 mL PBS缓冲液重悬细胞,再次离心弃上清,重复3次,最后重悬细胞于0.2mL PBS中。

8. 用锡箔纸包住避光,将细胞加入流式管中,在EPICS XL流式细胞仪上分析。 IR检测

GLUT4检测

(因为IR 和GLUT4同样为鼠源抗体,并且分开进行检测,二抗颜色可进行调试。尽可能选择效果好的同一种二抗。可能使用一绿一红,也可能使用两个同样颜色的二抗)

范文四:流式细胞仪步骤 投稿:钱瓄瓅

流式细胞术分析细胞周期时相 实验原理:流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中,在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出,形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测,得到该细胞的光散射和荧光指标,分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。

细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化,如G0/G1期的DNA含量为2C,而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法,通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定,可分析细胞周期各时相的百分比。 仪器:流式细胞仪,细胞培养设备,离心机,水浴,冰箱

材料:HeLa细胞,5ml注射器,离心管,封口膜,微量移液器,Tips

试剂:70%乙醇(保存于4℃),RNase-A (10mg/ml,-20℃保存),

PI (650µg/ml,避光保存于-20℃),PBS(pH 7.4,保存于4℃)

实验步骤:

取对数生长期细胞,倒去培养液,胰酶适度消化细胞,用培养液吹打,800rpm , 离心 15 min去上清。

•PBS洗2次,加0.5mL PBS吹匀,务必吹散。

•用5mL注射器将细胞吸起,用力打入5mL 70%(预冷)乙醇中,封口膜封口。4℃固定过夜(可长至2周)

•800rpm 15min收集固定细胞,PBS洗2次

•用0.4mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打(防止细胞破碎)

•加RNase-A约3µL至终浓度约为50µg/mL ,37℃水浴消化30 min;

•加PI约50µL至终浓度约为65µg/mL ,在冰浴中避光染色30 min。

•用300目(孔径40~50微米)尼龙网过滤,上机检测

范文五:细胞复苏的步骤 投稿:莫喊喋

主要器材:一次性滴管、打火机、酒精灯、大镊子、中镊子、记号笔、废液缸、封口膜、剪子。

主要试剂: PBS、培养液、消化酶(胰酶)、75%酒精、双抗。 PBS配制:NaCL :4g KCL:0.1g Na2HPO4 :1.745g KH2PO4 :0.1g

三蒸水:500mL,溶解后高压灭菌。

培养基配制:5mL双抗、50mL血清,加入培养基中。

细胞复苏步骤:

1、 水浴锅打开,调到35.8°C~37°C。

2、 打开超净台,放入主要用具,开紫外灭菌30min。(主要器具包

含:镊子、离心管、酒精灯、封口膜、一次性滴管、培养瓶、废液缸。)

3、 将培养液带入细胞间,瓶上喷酒精,放入超净台,过火,撕封口

膜,过火灭菌。

4、 用滴管取3ml培养液放入离心管中。

5、 从液氮中取出螺口瓶,放入之前开好的水浴锅中迅速融化。

6、 快速去细胞间,喷洒酒精灭菌,开盖,将细胞吸出放入离心管中,

1000转离心5min。

7、 培养瓶中加入5ml培养液,过火灭菌。

8、 取出离心管,倒掉培养液,用滴管取1ml培养液冲洗离心好的细

胞,移到培养瓶中,轻轻摇匀,显微镜下观察。

喷酒精灭菌,放入孵育箱中。整理超净台。

范文六:细胞转染的步骤 投稿:曾鏆鏇

【试剂与仪器】

1 .小牛血清。

2 .双抗溶液(链霉素 100μg+ 青霉素 100 单位)。

3 . DMEM 培养基。

4 .转染试剂( LIPOFECTAMINE 2000 )。

5 .细胞培养基( DMEM+10%NCS )。

6 . PBS 。

7 .无血清培养基。

8 .胰酶( Trypsin )。

9 .培养皿,移液管,量筒,恒温水浴箱,离心机, 15ml 离心管,微量移液器,荧光显微镜和 CCD 。

【操作步骤】

1 .转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板,使其在转染日密度为 90% 。细胞铺板在 0.5ml 含血清,不含抗生素的正常生长的培养基中。

2. 对于每孔细胞,使用 50μl 无血清 DMEM 培养基稀释 0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。

3. 对于每孔细胞,使用 50μl DMEM 培养基稀释 1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。 LIPOFECTAMINE 2000 稀释后,在 5 分钟内同稀释的 DNA 混合。保温时间过长会降低活性。

4. 混合稀释的 DNA (由第 2 步)和稀释的 LIPOFECTAMINE 2000 (由第 3 步)。在室温保温 20 分钟。注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。复合物可以在室温保持 6 小时稳定。

5. 直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。注意:如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,替换为 0.5ml 无血清培养基。

6. 在 37℃ , 5 %的 CO 2 中保温 24-48 小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在 4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。

7. 在细胞中加入复合物 24-72 小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

范文七:细胞爬片步骤 投稿:任堕堖

细胞爬片

细胞爬片

【玻片的准备】

1. 爬片可用一般的盖玻片,也可用专用爬片; 2.将剪裁好的爬片,置于浓硫酸中浸泡并过夜,第二天先用自来水冲洗20遍,再用三蒸水冲洗3遍,放在饭盒或者培养皿中烘干后进行高压消毒再烘干。

4.多聚赖氨酸处理玻片,以使细胞与玻片结合更牢。

【细胞爬片】

1. 胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2. 加细胞时,根据玻片的大小,先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基,目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起,然后放玻片,防止加细胞悬液时玻片漂起,造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。

3. 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可。

4. 待细胞贴壁后,可去上清加含药培养基。

5. 按照实验设计,作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧,张力较大,我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩,这样将爬片轻轻勾起,用小镊子取出就可以了。将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

【细胞爬片的固定】

1.细胞爬片取出后,一般用PBS洗x2遍,然后再做固定。

2.室温固定15分钟后,弃去固定液,PBS洗3x3min,洗尽液体。

3.将表面液体吹干,入-20℃保存

以下为常用的固定液

(1). 多聚甲醛(常用4%):可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,

室温固定15分钟后,将表面液体吹干,入-20℃保存

(2). 甲醛(福尔马林)应用最广缺点:甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色;分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

(3). 冷丙酮可用于一般的免疫组化染色。

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(4). 95%乙醇,可用于免疫组化。优点:穿透性强、抗原性保存较好。缺点:但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差,使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度

范文八:细胞培养的基本步骤 投稿:周榁概

一.发展概况

组织培养(Tissue culture)是在体外模拟体内生理环境,在无菌、适当温度和一定营养条件下。使从体内取出的组织生存、生长繁殖和传代,并维持原有的结构和功能特性。广义的组织培养与体外培养同义。体外培养(Invitro)包括所有结构层次的培养,即:组织培养、细胞培养和器官培养。

所谓细胞培养(Cell culture)是指细胞包括单个细胞在体外条件的生长。

组织培养的发展史已有近百年,最初的组织培养是胚胎学和微生物学的引申,建立于无菌原则上,用天然体液(如胎汁、血浆)来维持从整体切下的组织块,对细胞进行形态和功能的观察。

通过许多学者大的改进和革新,培养基由天然动物血浆改为合成培养基,促进细胞生长物质从胎汁改为动物血清。现在全世界贮存的细胞约有万种以上。组织培养不仅是细胞生物学必需的技术,也是分子生物学、肿瘤学、遗传学和免疫学等学科必要的方法。

二.基本原理和方法

体外培养细胞的生存条件:

(一)营养。

体外培养细胞所需的营养物质与体内相同,主要有糖、氨基酸和维生素三大类。目前市面上销售的合成培养基如1640、199等所含的氨基酸已足够,但在使用合成培养基时,仍需加入一些天然成份,如人或动物的血清、血浆和胎汁等。目前主要使用血清,以牛血清为主。血清的生物效应早已证明,它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等。不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。不同血清对细胞作用不同。以小牛血清最好,成年牛和马血清次之。合成培养基中不加血清也能维持细胞生存,但不能很好生长,加入5%的血清,对大多数细胞来说,能维持细胞不死和缓慢生长,要使细胞正常生长,一般需加 10~15%的小牛血清。每个批号血清使用前要加热处理,一般灭活于56℃水浴中30分钟,每个批号血清使用前要加热处理,一般灭活于56℃水浴中30分钟,每5分钟摇一次。10%血清营养液能促进细胞增殖称为生长液,2~5%血清培养液不能使细胞增殖而只能维持其生存称为维持液。添加血清,虽利于细胞生长,但增加了不明成分,给分析实验结果带来了困难。因此,人们正在探索不用血清的无血清液并已取得了一定进展。

(二)环境

1.无菌:无菌是保证培养细胞生存的首要条件。培养液不仅对细胞是高营养物,对细菌和霉菌也是高度营养物,细胞培养中如污染微生物,其繁殖比细胞快且能产生毒素使细胞死亡,因此细胞培养技术的关键之一是防止污染。污染微生物可来源于组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身。因此,培养室的空气等要彻底消毒,所有操作均要严格实行无菌操作,各种物品拿入操作台前应消毒,用洒精擦表面,用前于紫外线照;操作者洗手、泡手,酒精擦手,打开培养管前须在火焰上烙烧一下瓶口以使灰尘固定,操作时须将瓶、管斜放,吸管注入液体应避免和瓶口接触,操作时禁止讲话。

2.温度:组织培养的最适温度为35-37℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢和生长将会受到影响,甚至导致死亡。培养细胞对低温的耐受力比高温强。温度增加2-3℃对细胞产生不良影响,使之在24小时死亡,温度在43℃以上,细胞大多被杀灭,而低温对细胞影响较小,细胞置于25-35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度缓慢,放在4℃数小时之后,再置37℃培养,细胞仍能继续生长。

3.气体:气体也是细胞生存的必需条件之一。所需的气体主要有O2和CO2。O2参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。 CO2既是细胞代谢产物也是细胞所需成分。它主要与维持培养液pH值有直接关系。

4.pH值:多数细胞的适宜pH值为7.0-7.4,偏离此范围对细胞可产生有害的影响。各种细胞对pH值的要求也不完全相同,但总的来说,细胞耐酸性比耐碱性大一些。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐/ CO2。细胞代谢产生的各种酸使pH下降,而培养液中的NaHCO3产生CO2排入空间又使pH增加。

5.培养器皿的处理:培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大,除少数悬浮生长的细胞外,绝大多数细胞属于贴壁依赖性细胞或培养物。它们只有贴附于不起化学作用的物体的表面时,才能生长、生存或维持功能。目前,常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸泡1至7天,清水冲洗20次后再用蒸馏水过洗2次,烤干备用。用前160℃高温消毒2小时后使用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小时后,清水洗净再用 1N HCL浸泡4小时,用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗,37℃干燥后,紫外线灯照射消毒;新橡皮塞须先用1/2NnaOH煮沸15分钟,冲洗后再用4%HCL煮沸15分钟,清水冲洗后用蒸馏水洗5次,煮沸10分钟灭菌,或送高压灭菌。

总之,细胞在适当的培养条件下可迅速增殖,但若遇到不良环境细胞会变圆,停止生长,甚至死亡,这是细胞的保护机制。综上所述,细胞培养的基本条件主要包括了营养液、无菌条件、PH、温度、气体条件和培养器皿的清洁度。

三.常用的培养方法

根据培养物细胞生物学的特点,组织培养可分为原代培养和传代培养。亦可根据培养条件和器皿的不同而分为静置培养和动态培养。静置培养为最常见的方式,细胞可为贴壁型细胞,亦可为悬浮的不贴壁细胞。

(一) 传代细胞的静置培养

培养细胞的观察和传代:所有体外培养细胞,包括原代培养和各种细胞系(株),当生长达到一定的密度后,都需要做传代处理。传代的频率和间隔与接种细胞的数量、细胞生物学特性以及营养性质等有关。接种细胞多则细胞数饱和速度快;肿瘤细胞系比原代培养细胞增殖快,培养液中血清含量多时,细胞增殖快。一般是在细胞长满瓶壁、营养及PH稍降低时做传代培养,依据细胞特性,将一瓶细胞1:3或1:4传代。在细胞长满时,应尽早传代,否则细胞会中毒,形态发生改变,重则从壁上脱落死亡。传代过晚(若已有中毒迹象)能影响下一代细胞的机能状态,细胞需要再传一两代,把不健康的细胞除去,才能恢复使用。

那么,怎样才能做到及时传代呢?要做到及时传代,每天要仔细观察细胞的生长情况来决定是否要换液或传代。一般是形态观察,用倒置显微镜对活细胞形态、胞浆和胞膜进行观察。生长状态良好的细胞透明度大,细胞内颗粒少,看不见空泡,胞膜清晰,折光性强。培养上清液清晰透明,看不见悬浮的细胞和碎片。细胞机能不良时,胞质中常出现空泡,脂滴和其它颗粒状物,细胞之间空隙加大,细胞形态可变得不规则,甚至失去原有的特点。只有状态良好的细胞才能用来做实验。一般在细胞接种或传代后,每天或至多间隔1-2天,应观察细胞形态、细胞生长、培养液PH值和污染与否等,随时掌握细胞动态变化,以便于做换液或传代处理。如发现异常情况,及时采取措施。正常情况下,培养液呈桃红色,用一般温箱培养时,随细胞生长时间的延长,二氧化碳积累增多,由于培养基内有PH指示剂的存在,其颜色可间接反映细胞的生长状态。呈橙黄色时,细胞一般生长状态较好;呈淡黄色则可能是培养时间过长,营养不足,死亡细胞过多;呈紫红色则可能是细胞生长状态不好或已死亡。

(二) 培养细胞的保存和复苏

做实验前要先学会冻存,以备自己在后面的实验中能保持同一来源、稳定可靠的细胞,且可减少污染或其它不利影响。

1.影响冻存细胞活性的因素

(1)细胞冻存保护剂:常用的有二甲基亚砜(DMSO)和甘油,常用的浓度为5%-10%(90%

小牛血清)。DMSO对二倍体细胞的毒性较甘油小。

(2)细胞悬液的冻结速度:慢冻时冰冻在细胞外形成,因此不致损害细胞。多数细胞以每分钟下降1℃的速度,降至-20℃冻结。均可获得满意效果。

(3)保存温度:液氮罐,可达到-196℃,此时所有的物理化学活动均降至最低限度,以保证细胞长期保存。

(4)复苏:急速融化复苏可防止损害细胞。冻结细胞从液氮中取出后,应立即放入37℃~43℃的水浴中,30秒至一分钟内融化。

2.冻存与复苏方法

适用于原始组织、原代细胞和细胞系(株)。A.细胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用冻存液稀至2~5X106/ml。B.分装于2ml冻存管中,装量1ml,封口,作好标记,用几层纱布扎好。C.冻存管进入液氮前应有一个渐降温的过程,以1℃/min的速度降温,一般挂在液氮上空8小时后,投入液氮贮存罐中长期保存。D.为使冻存的细胞复苏,将冻存管置于37℃~43℃水浴中,充分摇动使其急速融化,30秒至1分钟内完成。E.细胞悬液低速离心,去除上清中的保护添加剂,加入原来使用的生长液,置37℃培养。

四.基本设备和试剂

设备(略),环境要求清洁、空气干燥和无烟尘。

基本试剂

培养液:①1640溶于新蒸的三次蒸馏水中,搅拌使其充分溶解,过滤除菌即可。②小牛血清用前56℃X30分钟灭活(破坏补体)分装置-20℃保存备用。③青链双抗液将100万单位的青霉素钠盐和硫酸链霉素用高压2次后的三蒸水100ml充分溶解,分装冻存于-20℃,使用前融化,每100ml生长液中加1ml,即使用终浓度为含P.S 100μg/ml。(注:P.S不能冻融多次,应少量分装,一次用完)。④NaHCO3液,用于调整pH值,常用浓度为5~6%,配制用三蒸水溶解后过滤除菌或高压灭菌,分装4℃保存。⑤胰蛋白酶 在pH 8.0,温度37℃时作用力最强(详见配方)。⑥EDTA液(详见配方)。

附:

胰酶消化液配方(500ml)

NaCL 4 g

KCL(19%) 1 ml

Na2HPO4 0.126g(12H2O)

Tris 1.5g(三羟甲基氨基甲烷)

以上药物充分溶解后加水至500 ml,然后再加胰蛋白酶5g,最后用1N HCL调pH至7.7,过滤除菌分装,然后-20℃保存备用。

EDTA液配方(0.2% 1000ml)

EDTA(versene) 2 g

NaCL 8 g

KCL 0.2g

Na2HPO4(12H2O) 2.9g

KH2PO4 0.2g

以上药物同样充分溶解后,加新鲜的三蒸水至1000 ml,分装然后高压15磅30分钟灭菌,最后4℃保存备用。

细胞冻存液:小牛血清90℅与二甲基亚砜(DMSO)10℅混合; -20℃冰箱保存备用。或小牛

血清30℅,1640培养液60℅,DMSO10℅混合; - 20℃冰箱保存备用。

原代培养

组织块培养法

组织块培养是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养法。即将组织剪切成小块后,接种于培养瓶。培养瓶可根据不同细胞生长的需要适当处理。例如预先涂以胶原薄层,以利于上皮样细胞等的生长。如果原代细胞准备做组织染色、电镀等检查,可在做原代培养前先在培养瓶内放置小盖破片,小盖破片要清洗干净,在消毒前放置。并在放入组织块前预先用1-2滴培养液湿润瓶底,使之固定。组织块法操作简便,部分种类的组织细胞在小块贴壁培养24h后、细胞就从组织块四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤,并不是每个小块都能长出细胞。组织块法特别适合于组织量少的原代培养如牙田细胞培养等。 用品

(1)Hank’s液(也可用无血清培养液),培养液

(2)培养瓶(必要时瓶内可放置小盖破片),吸管和胶帽杯(20 rnl)或青雷素小瓶

(3)眼科剪.眼科摄,小玻璃板(8cm×5cm)。牙科探针

步骤

(1)按照培养细胞取材基本原则和方法取材、修剪,将组织剪或切成1*1*1cm左右的小块。在剪切过积中.可以适当向组织上加1-2滴培养液,以保持湿润。

(2)将切好的组织小块。用眼科镊送入培养瓶内。用牙科探针或弯头吸管将组织块在瓶壁均匀摆置,每小块间距0.5cm左右。量不要多。25m1培养瓶(底面积约为17.5cm)以20-30小块为宜。如果瓶内有盖玻片、其上也放置几块。组织块放置好后,轻轻将培养瓶翻转,让瓶底朝上.向瓶内注入适量培养该,盖好瓶盖.将培养瓶倾斜放置存37度温箱。

(3)放置2—4h待组织小块贴附后.将培养瓶慢慢翻转平放、静置培养。这过程动作要轻巧.让液体缓缓覆盖组织小块。严禁动作过快液体产生冲力使粘贴的组织块漂起而造成原代培养失败。长组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。组织块培养也可不用翻转法。即在摆放组织块后。向培养瓶内加入少量培养液,以能保持组织块湿润即可。盖好瓶盖,放入温箱培养24h再补加培养液。

2 消化培养法

这种方法采用前述的组织消化分散法,将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除.使细胞分散.形成悬液,易于从外界吸收养分和排出代谢产物,可以很快得到大量活细胞,细胞也在短时间内生长成片。本方法适用于培养大量组织,原代细胞产量高;

但步骤繁琐、易污染.一些消化酶价格昂贵.实验成本高。

用品

各种消化液。

步骤

(1)消化分离法收获细胞。

(2)在消化过程中,可随时吸取少量消化液在镜下观察,如发现组织已分散成细胞团或单个细胞,则终止消化。通过孔径适当的筛网,滤绰组织块。大组织块可加新的消化液后继续消化。

(3)已过滤的消化液800-100urpm低速离心5min后,去除上清,加含血清培养液,轻轻吹打形成细胞悬液。如果用胶原酶或EDTA消化液等。尚需用Hanks液或培养液洗1-2次后再加

培养液。细咆计数后,接种培养版.置CO2温箱培养。

某些特殊类型细胞如内皮细胞、骨细胞等需特殊的消化手段。对悬浮生长的细胞,如白血病细胞、骨髓细胞合胸水、腹水含有癌细胞可不经消化直接离心分离或经淋巴分离液分离后接种,进行原代培养。

器官培养

器官培养是指从供休取得器官或器官组织块后、不进行组织分离而直接在体外的一定环境中培养。保持其原有器官细胞的结构和联系并生存。器官培养的目的和技术与单层细胞培养不同。可利用器官培养对器官组织的个长、变化进行休外观察,并可以通过改变外界条件研究对器官组织影响。器管培养主要强调器官组织的相对完整性,观察细胞正常联系和排列情况及它们之间的相互影响,和局部环境的生物调节作用。

器官培养的要求

(1)需要特殊的培养条件;由于离体组织没有血液系统供给养分,要维持组织细胞的生长需要。营养和氧气仅能靠自然渗透来维持。为使器官组织生长正常,中心不发生营养缺乏性坏死,组织的厚度或直径不宜超过1mm。

(2)器官组织内部细胞需要有足够的氧气渗入。一般采取两种方法:一是将器官组织块置放在培养基气液面,使其气体交换更容易;二是提高培养环境的氧分压。要根据组织类型而定,多数组织需较高氧分压,一般要加注纯氧。提高氧分压时,仍然需保持5%的CO2,以维持培养液的酸碱平衡。

不同的器官培养,尚需一些特殊的条件,如某些生长因子、激素等。

用品

除一般培养用品外还需以下器材:

(1)不锈钢筛网(用做支架)

(2)0.5um滤膜

(3)器官培养的培养皿

步骤

(1) 将不锈网做成支架形状调整其高度至培养皿的1/2深度平面,在其表面放置0.5um孔径滤膜。

(2) 将培养液加入培养皿,使液面刚刚接触列滤膜。但不要使其浮起。

(3) 将要培养器官组织放在滤膜上,一般厚度不要超过200um,水平面积不超过10*10cm,加组织为肝、肾等不能大于1*1*1mm。

(4) 将上述准备好的培养物放入CO2培养箱,并加注氧气,调整氧分压,最好到90%。

(5) 培养过程中要注意观察培养液平面,尽可能保持与滤膜—致的水平上。

上述可进行器官培养1-3周.每2-3天换液一次,并根据情况做进一步实验和检测。

传代培养

原代培养的首次传代

原代培养后由于细胞游出数量增加和细胞的增殖、单层培养细胞相互汇合,整个板底逐渐被细胞覆盖。这时需要进行分离

培养,否则细胞会因生存空间不足或密度过大,营养障碍,影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称为传代,进行一次分离再培养称之为传一代。初代培养的首次传代是很重要的,是建立细胞系关键的时期。在首次传代时一般要特别注意以下几点:

(1)细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前,不要急于传代。

(2)原代培养时细胞多为混杂生长,上皮样细胞和成纤维细胞并存的情况很多见,传代时不

同的细胞有不同的消化时间,而要根据需要注意观察及时进行处理。并可根据不同细胞对胰白酶的不同耐受时间而分离和纯化所需要的细胞。另外,早期传代的培养细胞较已经建系的培养消化时间相对较长。吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤。

(3)这次传代时细胞接种数量要多一些.使细胞能尽快适应

新环境而利于细胞生存和增殖。随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。 方法

培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代;部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代;悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打传代。

用品

(1)0.25%胰蛋白酶或其它消化液,培养液,Hank’s液

(2)滴管,离心管,培养瓶(皿),培养瓶盖,注射器、计数板,橡皮乳头

步骤

(1)贴壁细胞的消化法传代

①吸除或倒掉瓶内旧培养液

②以25mI培养瓶为例.向瓶内加入1m1消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)轻轻摇动培养瓶,使消化液流通所有细胞表面、然后吸掉或倒掉消化液后再加1—2ml新的消化液、轻轻摇动后再倒掉大部分消化液,仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤,直接加消化液进行消化。

③消化最好在37C或室温25C以上环境下进行。消化2-5min后把培养瓶放置显微镜下进行观察.发现胞质回缩、细胞间隙增大,应立即终止消化。

④吸除或倒掉消化液。用EDTA消化,需加Hank’s液数毫升,轻轻转动培养瓶把残留消化液消倒掉,然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液终止消化。

⑤弯头吸管吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞、吹打过程要顺序进行、从培养瓶底部一边开始到另一边结束,以确保所行底部都被吹散。吹打时动作要轻柔不要用力过猛同时尽可能不要出现泡沫.这些都对细胞有损伤。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。

⑥计数,分别接钟在新的培养瓶内。

(2 )悬浮细胞的传代

因悬浮生长细胞不贴壁。故传代时不必采用酶消化方法,而可直接传代或离心收集细胞后传代。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后。将上清吸掉1/2-2/3.然后用吸管吹打,形成细胞悬液后,再传代。悬浮细胞多采用离心方法传代,即将细胞连同培养液一并转移到离心管内,离心800-1000rpm,5min,然后去除上清,加新的培养液到离心管内,用吸管吹打使之形成细胞悬液,然后传代接种。

部分贴壁生长细胞.不经消化处理直接吹打也可使细胞从壁上脱落下来,而进行传代。但这种方法仅限于部分贴壁不牢的细胞,如Hela细胞等。直接吹打对细胞损伤较大,细胞常也有较大数量丢失,因而绝大部分贴壁生长的细胞均需消化后,才能吹打传代。

范文九:细胞复苏的步骤 投稿:周煑煒

主要器材:一次性滴管、打火机、酒精灯、大镊子、中镊子、记号笔、废液缸、封口膜、剪子。

主要试剂: PBS、培养液、消化酶(胰酶)、75%酒精、双抗。 PBS配制:NaCL :4g KCL:0.1g Na2HPO4 :1.745g KH2PO4 :0.1g

三蒸水:500mL,溶解后高压灭菌。

培养基配制:5mL双抗、50mL血清,加入培养基中。

细胞复苏步骤:

1、 水浴锅打开,调到35.8°C~37°C。

2、 打开超净台,放入主要用具,开紫外灭菌30min。(主要器具包

含:镊子、离心管、酒精灯、封口膜、一次性滴管、培养瓶、废液缸。)

3、 将培养液带入细胞间,瓶上喷酒精,放入超净台,过火,撕封口

膜,过火灭菌。

4、 用滴管取3ml培养液放入离心管中。

5、 从液氮中取出螺口瓶,放入之前开好的水浴锅中迅速融化。

6、 快速去细胞间,喷洒酒精灭菌,开盖,将细胞吸出放入离心管中,

1000转离心5min。

7、 培养瓶中加入5ml培养液,过火灭菌。

8、 取出离心管,倒掉培养液,用滴管取1ml培养液冲洗离心好的细

胞,移到培养瓶中,轻轻摇匀,显微镜下观察。

喷酒精灭菌,放入孵育箱中。整理超净台。

范文十:细胞冻存步骤 投稿:洪踬踭

一、复苏

1.把冻存管从液氮中取出来,立即投入42℃水浴锅中,轻微摇动。液体都融化后(大概1-2分钟)。

2.把上述细胞悬液吸到恶评EP管或离心管中,1200转离心5分钟。

3.把上清液倒掉,加1ml培养基把细胞完全悬浮。吸到装有培养基的10cm培养皿或培养瓶中前后左右轻轻摇动,使细胞均匀分布。

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等,放到CO2培养箱中培养,细胞贴壁后换培养基。

5.2或3天换一次培养基。

二、传代

1.培养皿中的细胞生长率达到80%-90%时要传代。

2.把原来的培养基吸掉,加PBS冲洗1到2次,弃掉PBS。

3.加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行),消化1-3分钟。

4.待细胞都变圆后加如入含血清的培养基终止消化。

5.用移液枪吹打细胞,把细胞完全都悬浮起来。

6.把细胞吸到EP管或离心管中,1200转离心5分钟。

7.倒掉上清液,加1-2ml培养基,把细胞完全都吹起来。

8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿或培养瓶中。

三、冻存

细胞处理同二步骤中的前6步。第七步用配好的冻存液把细胞悬浮起来,分装到冻存管中,写明细胞种类,冻存日期。4℃10min,-20℃30min,-80℃过夜,然后放到液氮灌中保存。或直接放冻存盒中,再放到-80冰箱。

冻存液的配制:FBS:完全培养基:DMSO=5:4:1

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