大肠菌群的测定_范文大全

大肠菌群的测定

【范文精选】大肠菌群的测定

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【专家解析】大肠菌群的测定

【优秀范文】大肠菌群的测定

范文一:大肠菌群的测定 投稿:胡雖雗

大肠菌落计数的平板计数法

检验方法:

分离培养与菌种鉴定、计数:

1.1 样品的稀释

1.1.1 固体和半固体样品:称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,

8000 r/min~10000 r/min 均质1 min~2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋

中,用拍击式均质器拍打1 min~2 min,制成1:10 的样品匀液。

1.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶

(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10 的样品匀液。

1.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5~7.5 之间,必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。

1.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL,沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液

或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1 支1 mL 无菌

吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:100 的样品匀液。

1.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每

递增稀释

1 次,换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15 min。

1.2 平板计数

1.2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1 mL。同时取1 mL生理盐

水加入无菌平皿作空白对照。

1.2.2 及时将15 mL~20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心

旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平

板,置于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。

1.3 平板菌落数的选择

选取菌落数在15 CFU~150 CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。

典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5 mm 或更大。

1.4 证实试验

从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于BGLB 肉汤管内,36 ℃±1 ℃

培养24 h~48 h,观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。

1.5 大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以1.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g

(mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1 mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取

其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105 CFU/g(mL)。

范文二:粪大肠菌群的测定 投稿:钱尨尩

LPEMS⁄ZYA-43-2011

生活饮用水中耐热大肠菌群、总大肠菌群、

大肠埃希氏菌的测定

——酶底物法

一、 实验原理

该革新的检测技术利用分别由大肠菌群β-半乳糖苷酶及大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶代谢的两种「营养剂─指示剂」:邻硝基苯-β-D-半乳派喃糖(ONPG)及甲基香豆基葡糖醛酸苷(MUG),作为Colilert试剂的主要碳源。

1、利用大肠菌群细菌能产生β2 半乳糖苷酶分解ONPG 使培养液呈黄色,检测大肠菌群;

2、利用大肠埃希氏菌产生β2 葡萄糖醛酸酶分解MUG 使培养液在波长366nm 紫外光下产生蓝色荧光,检测大肠埃希氏菌;

3、改变培养温度,可检测耐热大肠菌群。

因为大多数非─大肠杆菌属菌类没有这些酶,所以无法在Colilert试剂里生长及干涉这些物质。而有这些酶的少数非─大肠杆菌属菌类会受到Colilert特殊配方的基质选择性的抑制作用(专利技术)。

二、 仪器和试剂耗材

1、检测设备—程控定量封口机Quanti-Tray

Sealer Model 2X 美国IDEXX;

2、可充电紫外灯,6W,220V,366nm;

3、紫外线防护镜;

4、DST酶底物法24小时Colilert试剂 美

程控定量封口机

国IDEXX;

5、51孔定量盘(无菌);97孔定量盘

(无菌)

6、阳性标准比色瓶,阳性51孔标准比

色盘;

7、100mL含硫代硫酸钠无菌取样袋/瓶;

MUG试剂(科立得) 定量盘(51孔或者97孔) 取样瓶

8.记号笔;

9.无菌剪刀;

10.无菌夹子;

11.一次性医用无菌手套。

四、实验步骤

1.操作流程图

酶底物法即可以作定性又可以作定量分析,同时检测两个指标,总大肠菌群(total coli)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli),方法简便,快速,结果准确。

2.操作说明

注意:如果不按照说明使用机器,可能会有人员伤害、机器损害、其他财产损害以及出现检测结果不准确。

(1) 操作前后或离开实验室必须用肥皂或消毒液洗手。

(2) 打开电源开关,橙黄色指示灯应当亮起。

(3) 程控定量封口机需要预热直到绿色指示灯亮起(大约10分钟)。只有当两个灯都亮时,才说明机器达到工作温度。

(4) 大肠菌群、大肠埃希氏菌:取100mL水样加入酶底物试剂1支混匀,转入51孔或97孔定量盘内(注意:在取水样和去定量盘时手不能触碰到含有少

量硫代硫酸钠的无菌取样瓶及定量盘封口处,以免影响检测结果),封口后于36±1℃培养24h,观察结果。耐热大肠菌群:实验同上,但培养温度变为44.5±0.5℃

(5) 把橡胶垫放到进口托盘架上,有大矩形孔的一头在外。

(6) 把装有样品和DST Colilert试剂的定量托盘放入橡胶垫中,注意定量托盘的每个凹陷要对准橡胶垫上对应的空。

(7) 向机器方向轻轻推动橡胶垫,直到机器抓住橡胶垫,并带动其进入机器。

(8) 大约15秒钟,定量托盘封口完成,从机器后出来。请从机器后拿出橡胶垫和定量托盘。

(9) 任何时候,如果需要使机器反转,从前面退出橡胶垫(例如当定量托盘没放平就将橡胶垫放入机器),请按反转钮。但是,当橡胶垫已经完全进入机器中,请不要按反转开关。如果有多个橡胶垫,可以连续放入机器。

(10) 在暗室中,使用6瓦,366nm的紫外灯在距样品15厘米左右的位置观测是否显荧光。

(11) 结果应在24-28小时内读取。此外,总大肠菌群和大肠埃希氏菌培养时间小于24小时已经为阳性;或总大肠菌群和大肠埃希氏菌大于28小时依然为阴性,则结果也有效。

◆注意:

1.检测试剂于2—30°避光储存;

2.a.使用过的取样统一收集进行灭菌处理;

b.橡胶插垫可以放到高压消毒锅中进行消毒,也可以用异丙醇或家用漂白剂清洗。清洗时应注意这些清洗剂的危害。要经常清洗橡胶插垫,确保橡胶插垫上不要有污垢。

一般情况下可使用柔软的干布清洗封口机外壳。也可以用异丙醇或家用漂白剂清洗,但要注意个人防护。

只有专门指定的人员才可以打开封口机的前挡盖。请参照保养手册,清洗封口机的内部。清洗工作一定要有经过培训的人员来完成。如果有样品从机器中滴

出,请不要打开前挡盖或使得封口机倾斜;

3.拿出定量盘后应尽快用无菌夹子夹住袋口,以免剩余定量盘被细菌感染;

4.使用后关掉机器;

5.

附表:

1.51孔定量盘法不同阳性结果的MPN值表

2.97孔定量盘法不同阳性结果的MPN值表

范文三:3M大肠菌群的测定 投稿:孙侻侼

食品卫生微生物学检验 大肠菌群的测定 国标(GB/T 4789.3—2008) 国标(GB/T 4789.3—2008)

实验目的

学习并掌握国标GB/T 4789.38—2008标准中 规定食品中大肠菌群的测定方法。

大肠菌群系指一群能发酵乳糖,产酸产气。需氧 和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源 于人畜粪便,故此作为粪便污染指标来评价食品的卫 生质量,具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否 被粪便污染,同时间接地指出食品是否有肠道致病菌 污染的可能性。

食品中大肠菌群快速计数法 - Petrifilm™ 测试片法

原理

PetrifilmTM大肠菌群测试片 (PetrifilmTM Coliform Count Plate) 是一种预先制备好的培养基系统,含 有VRB (Violet Red Bile) 培养基,冷水可溶性凝胶 和氯化三苯四氮唑(TTC)指示剂,可增强菌落计数效 果。表面覆盖的胶膜,可截留发酵乳糖的大肠菌群产 生的气体。培养结束后计数红点周围有气泡的菌落为 大肠菌群数。

3M PetrifilmTM测试片的结构

设备和材料

1. 恒温培养箱:36±1℃ 2. 均质器(旋刀式或拍击式)或等效的设备。 3. pH计或精密pH试纸。 4. PetrifilmTM测试片压板。 5. 放大镜或/和菌落计数器或PetrifilmTM自动判读仪。

操作步骤

1. 样品制备 制备的1:10样品匀液,无菌操作调节样品匀液的 pH为6.5~7.5,酸性样液用1mol/L NaOH调节,碱性 样液用1 mol/L HCl调节。 2.稀释 对上述样品匀液做10倍系列梯度稀释,根据样品的 污染程度,选取适宜的2~3个连续稀释度,每个稀释 度接种2张测试片。

3. 接种 将PetrifilmTM大肠菌群测试片或PetrifilmTM 大肠杆菌/大肠菌群测试片置于平坦实验台面,揭开 上层膜,用吸管吸取1 mL样液垂直滴加在测试片的 中央,将上层膜缓慢盖下,避免气泡产生和上层膜 直接落下,把压板(平面底朝下)放置在上层膜中 央,轻轻地压下,使样液均匀覆盖于圆形的培养面 积上。拿起压板,静置至少1 min以使培养基凝固。

4. 培养

将测试片的透明面朝上水平置于培养箱内,堆 叠片数不超过20片,培养温度为36±1℃。 大肠菌群检测时培养时间为24±2h;大肠杆菌检 测时,如果是肉、家禽和水产品培养时间为24±2h, 如果是其它产品,培养时间为48±2h。

结果计算与报告

1.判读 目视、用菌落计数器、放大镜或PetrifilmTM自动 判读仪来计数。 在PetrifilmTM大肠菌群测试片上,红色有气泡的 菌落确认为大肠菌群数。培养圆形面积边缘上及边 缘以外的菌落不作计数。当培养区域出现大量气泡, 大量不明显小菌落或培养区呈暗红色三种情况,表 明大肠菌群的浓度较高,进一步稀释样品可获得准 确的读数。

在PetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌群测试片上, 蓝色有

气泡的菌落确认为大肠杆菌。蓝色有气泡 和红色有气泡的菌落数之和为大肠菌群数。培养 圆形面积边缘上及边缘以外的菌落不做计数。出 现大量气泡形成、不明显的小菌落,培养区呈蓝 色或暗红时,进一步稀释样品可获得准确的读数。

2. 菌落计数 选取目标菌落数在15~150之间的测试片,计数 菌落数,乘以相对应的稀释倍数报告之。如果所有 稀释度测试片上的菌落数都小于15,则计数稀释度 最低的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告;如 果所有稀释度的测试片上均无菌落生长,则以小于 1乘以最低稀释倍数报告;如果最高稀释度的菌落数 大于150个时,计数最高稀释度的测试片上的菌落数 乘以稀释倍数报告。

计数菌落数大于150个的测试片时,可计数一 个或两个具有代表性的方格内的菌落数,换算成 单个方格内的菌落数后乘以20即为测试片上估算的 菌落数(圆形生长面积为20 cm2)。食品中最终菌 落浓度的单位以“cfu/g (mL)”表示,表面上菌落数以 “cfu/cm2”表示。

3M PetrifilmTM 大肠菌群测试片

• 含有改良的VRB培养基 • 目标菌落为红色带气泡 • 35±1°C, 24 ±2 h培 养 • AOAC Offical Method 991.14

3M PetrifilmTM 大肠杆菌/大肠菌群测试片

样品制备

样品制备

接种

接种

接种

培养

解释

范文四:粪大肠菌群测定 投稿:宋橗橘

本电子版为发布稿。请以中国环境科学出版社出版的正式标准文本为准。

HJ

中华人民共和国环境保护行业标准

HJ/T 347─ 2007

水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法(试行)

Water quality—Determination of fecal coliform—manifold zymotechnics

and filter membrane

(发布稿)

2007-03-10 发布 2007-05-01 实施

国家环境保护总局 发 布

HJ/T 347—2007

目 次

前言 …………………………………………………………………………………………………Ⅱ 第一篇 多管发酵法

1 适用范围 ……………………………………………………………………………………… 1 2 原理 …………………………………………………………………………………………… 1 3 培养基和试剂 ………………………………………………………………………………… 1 4 步骤 …………………………………………………………………………………………… 2 5 结果的计算 …………………………………………………………………………………… 2 第二篇 滤膜法

1 适用范围 ……………………………………………………………………………………… 4 2 原理 …………………………………………………………………………………………… 4 3 培养基和试剂 ………………………………………………………………………………… 4 4 步骤 …………………………………………………………………………………………… 5 5 结果的计算 …………………………………………………………………………………… 6

前 言

为规划《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)的实施工作,制定本试行标准。 本标准规定了地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的多管发酵法和滤膜法。 本标准适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。 本标准为首次制订。

本标准由国家环境保护总局科技标准司提出。

本标准由国家环境保护总局水和废水监测分析方法编委会组织中国环境监测总站等单位起草。 本标准国家环境保护总局2007年3月10日批准。 本标准自2007年5月1日起实施。 本标准由国家环境保护总局解释。

水质 粪大肠菌群的测定

粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分,主要来自粪便。在44.5℃温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。用提高培养温度的方法,造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件,使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群,从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。粪大肠菌群的测定可以用多管发酵法和滤膜法。

第一篇 多管发酵法

1 适用范围

本标准适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。

2 原理

多管发酵法是以最可能数(most probable number)简称MPN来表示试验结果的。实际上它是根据统计学理论,估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑,并且进行大量的重复检定,可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加,这种差异便会减少,对于细菌含量的估计值,大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上,水样检验所要求重复的数目,要根据所要求数据的准确度而定。

3 培养基和试剂

本标准所用试剂除另有注明外,均为符合国家标准的分析纯化学试剂;实验用水为新制备的去离子水。

3.1单倍乳糖蛋白胨培养液:

成分: 蛋白胨 10g

牛肉浸膏 3g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL

蒸馏水 1000mL

制法:将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中,调节pH为7.2~7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀,分装于含有倒置的小玻璃管的试管中,于高压蒸汽灭菌器中,在115℃灭菌20min,贮存于暗处备用。 3.2 三倍乳糖蛋白胨培养液:按上述配方比例三倍(除蒸馏水外),配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液,制法同上。

3.3 EC培养液:

成分: 胰胨 20g

乳糖 5g 胆盐三号 1.5g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 4g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL

制法:将上述成分加热溶解,然后分装于含有玻璃倒管的试管中。置高压蒸汽灭菌器中,115℃灭菌20min。灭菌后pH应为6.9。 3.4 培养基的存放

在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处,存放时应避免阳光直接照射,并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化,或体积变化明显时废弃不用。

4 步骤

4.1 水样接种量

将水样充分混匀后,根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。

相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL或0.1mL、0.01mL、0.001mL等。使用的水样量可参考下表1。

表1 接种用水量参考表

水样种类 井水

河水、塘水 湖水、塘水 城市原污水

检测方法 多管发酵法 多管发酵法 多管发酵法 多管发酵法

接种量(mL)

100 50 10 1 0.1 10-2 10-3 10-4 10-5 × × × × × × × × × × × ×

如接种体积为10mL,则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL;如接种量为1mL或少于

1mL,则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中。 4.2 初发酵试验

将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃下培养24h±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显,可轻拍试管,有小气泡升起的为阳性。 4.3 复发酵试验

轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管,用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h(水浴箱的水面应高于试管中培养基液面)。接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中。培养后立即观察,发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。

5 结果的计算

根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目,从表2或表3中查得每升水样中的粪大肠菌群。接种水样为100mL2份、10mL10份、总量300mL时,查表2可得每升水样中的粪大肠菌群;接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时,查表3求得MPN指数,MPN值再乘10,即为1L水样中的粪大肠菌群。

如果接种的水样不是10mL、1mL和0.1mL,而是较低的或较高的三个浓度的水样量,也可查表3求得MPN值,再经下式计算成每100mL的MPN值。

MPN值=MPN指数×

10(mL)

接种量最大的一管mL表2 粪大肠菌群检数表

(接种水样100mL2份、10mL10份、总量300m)

100mL水量的阳性瓶数

10mL水量的阳性管数

1L水样中粪大肠菌群数

1L水样中粪大肠菌群数

1L水样中粪大肠菌群数

0 1 2

0 <3 4 11 1 3 8 18 2 7 13 27 3 11 18 38 4 14 24 52 5 18 30 70 6 22 36 92 7 27 43 120 8 31 51 161 9 36 60 230 10 40 69 >230

表3 最可能数(MPN)表

(接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时,不同阳性及阴性

情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95%可信限值)

每100mL水出现阳性份数 95%置信区间

10mL 1mL 0.1mL 样中细菌数

下限 上限

的最可能数 管 管 管 0 0 0

0 0 1 0 1 0 0 2 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 2 0 2 0 0 2 0 1 2 1 0 2 1 1 2 2 0

<2 2 2 4 2 4 4 6 6 5 7 7 9 9

每100mL水出现阳性份数 95%置信区间

10mL1mL 0.1mL样中细菌数

下限 上限

的最可能数 管 管 管

26

27 33 34 23 34 43 33 46 63 49 70 94 79

4 2 1 <0.5 7 4 3 0 <0.5 7 4 3 1 <0.5 11 4 4 0 <0.5 7 5 0 0 <0.5 11 5 0 1 <0.5 11 5 0 2 <0.5 15 5 1 0 <0.5 15 5 1 1 <0.5 13 5 1 2 1 17 5 2 0 1 17 5 2 1 2 21 5 2 2 2 21 5 3 0 9 78 9 80 11 93 12 93 7 70 11 89 15 110 11 93 16 120 21 150 17 130 23 170 28 220 25 190

2 3 0 3 0 0 3 0 1 3 1 0 3 1 1 3 2 0 3 2 1 3 3 0 4 0 0 4 0 1 4 1 0 4 1 1 4 1 2 4 2 0 12 8 11 11 14 14 17 17 13 17 17 21 26 22 3 28 5 3 1 110 31 250 1 19 5 3 2 140 37 310 2 25 5 3 3 180 44 500 2 25 5 4 0 130 35 300 4 34 5 4 1 170 43 190 4 34 5 4 2 220 57 700 5 46 5 4 3 280 90 850 5 46 5 4 4 350 120 1000 3 31 5 5 0 240 68 750 5 46 5 5 1 350 120 1000 5 46 5 5 2 540 180 1400 7 63 5 5 3 920 300 3200 9 78 5 5 4 1600 640 5800 7 67 5 5 5 ≥2400

第二篇 滤膜法

1 适用范围

本标准适用于一般地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。用于检验加氯消毒后的水样时,在滤膜法之前,应先做实验,证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。

2 原理

滤膜是一种微孔性薄膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜(孔径0.45μm)的滤器中,经过抽滤,细菌即被截留在膜上,然后将滤膜贴于M−FC培养基上,44.5℃温度下进行培养,计数滤膜上生长的此特性的菌落数,计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。

3 培养基和试剂

本标准所用试剂除另有注明外,均为符合国家标准的分析纯化学试剂;实验用水为新制备的去离子水。

3.1 M−FC培养基:

成分: 胰胨 10g

蛋白胨 5g 酵母浸膏 3.0g 氯化钠 5.0g 乳糖 12.5g 胆盐三号 1.5g 1%苯胺蓝水溶液 10mL

1%玫瑰色酸溶液(溶于0.2mol/L氢氧化钠液中) 10mL

蒸馏水 1000mL

制法:将上述培养基中的成分(除苯胺蓝和玫瑰色酸外),置于蒸馏水中加热溶解,调节pH为7.4,

分装于小烧瓶内,每瓶100mL,于115℃灭菌20min。贮于冰箱中备用。临用前,按上述配方比例,用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1mL及新配制的1%玫瑰色酸溶液(溶于0.2mol/L氢氧化钠液中)1mL,混合均匀。加热溶解前,加入1.2%~1.5%琼脂可制成固体培养基。如培养物中杂菌不多,则培养基中不加玫瑰色酸亦可。 3.2 培养基的存放

在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处,存放时应避免阳光直接照射,并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化,或体积变化明显时废弃不用。

4 步骤

4.1 水样量的选择:水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。如未知水样中粪大肠菌的密度,就应按下表所列体积过滤水样,以得知水样的粪大肠杆菌密度。先估计出适合在滤膜上计数所应使用的体积,然后再取这个体积的1/10和10倍,分别过滤。理想的水样体积是一片滤膜上生长20~60个粪大肠菌群菌落,总菌落数不得超过200个。使用的水样量可参考下表。

水样种类 较清洁的湖水 一般的江水 城市内的河水 城市原污水

检测方法 滤膜法 滤膜法 滤膜法 滤膜法

接种量(mL)

100 50 10 1×

× ×

× ×

××

0.1 × ×

10-2 10-3 10-4 10-5 × ×

×

4.2 滤膜及滤器的灭菌:将滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中煮沸灭菌三次,每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次,以除去残留溶剂。也可用121℃灭菌10min,10min一到,迅速将蒸汽放出,这样可以尽量减少滤膜上凝集的水分。滤器、接液瓶和垫圈分别用纸包好,在使用前先经121℃高压蒸汽灭菌30min。滤器灭菌也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。 4.3

过滤装置安装:以无菌操作把滤器装置依照下图装好。

4.4过滤:用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘,将粗糙面向上,贴放在已灭菌的滤床上,稳妥地固定好滤器。将适量的水样注入滤器中,加盖,开动真空泵即可抽滤除菌。

3.5 培养:使用M−FC培养基。培养基含或不含琼脂,不含琼脂的培养基使用已用M-FC培养基饱和的无菌吸收垫。将滤过水样的滤膜置于琼脂或吸收垫表面。将培养皿紧密盖好后,置于能准确恒温于44.5℃±0.5℃的恒温培养箱或恒温水浴中,经24h±2h培养。若用恒温水浴培养,则需用防水胶带贴封每个平皿,将培养皿成叠封入防水塑料袋或容器内,浸没在44.5℃±0.5℃恒温水浴中。在培养时间内,装培养皿的塑料袋必须用重物坠于水面之下,以保持所需的严格温度。所有已制备的培养物都应在过滤后30min内浸入水浴内。

5 结果的计算

粪大肠菌群菌落在M−FC培养基上呈蓝色或蓝绿色,其他非粪大肠菌群菌落呈灰色、淡黄色或无色。正常情况下,由于温度和玫瑰酸盐试剂的选择性作用,在M−FC培养基上很少见到非粪大肠菌菌落。必要时可将可疑菌落接种于EC培养液,44.5℃±0.5℃培养24h±2h,如产气则证实为粪大肠菌群。

计数呈蓝或蓝绿色的菌落,计算出每1L水样中的粪大肠菌群数。

粪大肠菌群菌落数(个/L)=

滤膜上生长的粪大肠菌群菌落数×1000

过滤水样量(ml)

范文五:大肠菌群测定 投稿:陈豀豁

大肠菌群测定.txt男人应该感谢20多岁陪在自己身边的女人。因为20岁是男人人生的最低谷,没钱,没事业;而20岁,却是女人一生中最灿烂的季节。只要锄头舞得好,哪有墙角挖不到?大肠菌群测定.txt如果我穷得还剩下一碗饭 我也会让你先吃饱全天下最好的东西都应该归我所有,包括你!!  先说喜欢我能死啊?别闹,听话。  有本事你就照顾好自己,不然就老老实实地让我来照顾你!  食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定

  1 主题内容与适用范围  本标准规定了食品中大肠菌群的测定方法。  本标准适用于食品中大肠菌群的测定。  2 术语  大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。  食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。  3 引用标准  GB 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂  4 设备和材料  4.1 温箱:36±1℃。  4.2 冰箱:0~4℃。  4.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。  4.4 天平。  4.5 显微镜。  4.6 均质器或乳钵。  4.7 平皿:直径为90mm。  4.8 试管。  4.9 吸管。    4.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。  4.11 玻璃珠:直径约5mm。  4.12 载玻片。  4.13 酒精灯。  4.14 试管架。  5 培养基和试剂  5.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。  5.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25沥规定。  5.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。  5.4 EC肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。  5.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。  5.6 生理盐水。  5.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。  6 检验程序  大肠菌群检验程序如下:  (图略)  7 操作步骤  7.1 检样稀释  7.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000~10000r/min的速度处理1min,做成1∶10的均匀稀释液。  7.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1∶100的稀释液。  7.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。  7.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个

稀释度,每个稀释度接种3管。  7.2 乳糖发酵试验  将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。  7.3 分离培养  将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18~24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。  7.4 证实试验  在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。  7.5 报告  根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。  8 粪大肠菌群(faecal coliform)   8.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见7.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃培养18~24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。  8.2 结果报告  根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。  大肠菌群最可能数(MPN)检索表

范文六:大肠菌群测定 投稿:廖绉绊

大肠菌群测定.txt如果你同时爱几个人,说明你年轻;如果你只爱一个人,那么,你已经老了;如果你谁也不爱,你已获得重生。积极的人一定有一个坚持的习惯。食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定

  1 主题内容与适用范围  本标准规定了食品中大肠菌群的测定方法。  本标准适用于食品中大肠菌群的测定。  2 术语  大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。  食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。  3 引用标准  GB 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂  4 设备和材料  4.1 温箱:36±1℃。  4.2 冰箱:0~4℃。  4.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。  4.4 天平。  4.5 显微镜。  4.6 均质器或乳钵。  4.7 平皿:直径为90mm。  4.8 试管。  4.9 吸管。    4.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。  4.11 玻璃珠:直径约5mm。  4.12 载玻片。  4.13 酒精灯。  4.14 试管架。  5 培养基和试剂  5.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。  5.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25沥规定。  5.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。  5.4 EC肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。  5.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。  5.6 生理盐水。  5.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。  6 检验程序  大肠菌群检验程序如下:  (图略)  7 操作步骤  7.1 检样稀释  7.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000~10000r/min的速度处理1min,做成1∶10的均匀稀释液。  7.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1∶100的稀释液。  7.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。  7.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度接种3管。  7.2 乳糖发酵试验  将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如

所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。  7.3 分离培养  将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18~24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。  7.4 证实试验  在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。  7.5 报告  根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。  8 粪大肠菌群(faecal coliform)   8.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见7.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃培养18~24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。  8.2 结果报告  根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。  大肠菌群最可能数(MPN)检索表

范文七:大肠菌群的测定 投稿:韦熉熊

FSPTSTG013糖果大肠菌群的测定乳糖发酵法F_SP_TS_TG_013

糖果

1

范围

本方法采用乳糖发酵法测定糖果中大肠菌群的MPN值。

本方法适用于糖果中大肠菌群的测定,以MPN/100mL报告其结果。2

原理

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。33.13.2

试剂

溴甲酚紫溶液,0.4g/L

乳糖胆盐发酵管:将蛋白胨20g、猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g及乳糖10g溶于1000mL水

大肠菌群的测定乳糖发酵法

中,校正PH至7.4,加入溴甲酚紫溶液25mL,混匀后分装每管10mL,并放入一个小倒管,115℃高压灭菌15min。。3.3

双料乳糖胆盐发酵管:将蛋白胨40g、猪胆盐(或牛、羊胆盐)10g及乳糖20g溶于1000mL

水中,校正PH至7.4,加入溴甲酚紫溶液50mL,混匀后分装每管10mL,并放入一个小倒管,

115℃高压灭菌15min3.4

乳糖发酵管:将蛋白胨20g及乳糖10g溶于1000mL水中,校正PH至7.4,加入溴甲酚紫

溶液25mL,混匀后按检验要求分装30mL、10mL、3mL,并放入一个小倒管,115℃高压灭菌

国中

1℃

0.5℃

15min。3.5

EC肉汤:将胰蛋白胨20g、3号胆盐(或混合胆盐)1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾4g、磷酸

二氢钾1.5g及氯化钠5g混合,溶于1000mL水中,溶解后分装有发酵倒管的试管中,并放入一

个小倒管,121℃高压灭菌15min,最终PH为6.93.6

0.2。

伊红美蓝琼脂平板:将蛋白胨10g、磷酸氢二钾2g及琼脂17g溶解于蒸馏水中,校正PH至

7.1分装于烧瓶内,121℃高压灭菌15min,临用时加入乳糖10g并加热溶化琼脂,冷至50~55℃,加入伊红美蓝溶液(6.5g/L)10mL,摇匀,倾注平板。3.7

革兰氏染色液:

3.7.1结晶紫染色液:将1g结晶紫溶解于20mL乙醇(950g/L)中,然后与80mL草酸铵溶液(10g/L)混合均匀。

3.7.2革兰氏碘液:将1g碘与2g碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。

3.7.3沙黄复染液:将0.25g沙黄溶解于10mL乙醇(950g/L)中,然后用蒸馏水稀释至100mL。44.14.2

仪器温箱:36恒温水浴:44.5

4.355.15.1.15.1.25.1.35.1.4

显微镜操作步骤检样稀释

用灭菌镊子夹去包装纸,称取数块共25g,加入预温至45℃的灭菌生理盐水225mL,等溶用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1根据饮料卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度接种3管。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量分别为10mL、1mL、0.1mL,接种量在lmL

化后检验,即为1:10稀释液。

试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。mL灭菌吸管。5.2乳糖发酵试验

以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,lmI,及lmL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36士l℃温箱内,培养24士2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。5.3分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36士1℃温箱内,培养18一24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。5.4革兰氏染色试验

将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗,然后滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗,再滴加乙醇(950g/L)脱色约30s,(或将乙醇滴满整个涂片,立即倾去,再用乙醇滴满整个涂片,脱色10s)水洗,最后滴加沙黄复染液复染1min。水洗,待干,镜检。革兰氏阳性菌呈紫色,阴性菌呈红色。5.5证实试验

在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36士1℃温箱内培养24士2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。5.6报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL大肠菌群的MPN值。6

参考文献

GB4789.3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定

GB4789.24-2003食品卫生微生物学检验糖果、糕点、蜜饯检验GB4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

国中

附表1

大肠菌群最可能数(MPN)检索表

阳性管数

1mL(g)

00000000000000001111111111111111222222

0.1mL(g)

00001111222233330000111122223333000011

0.01mL(g)

01230123012301230123012301230123012301

MPN100mL(g)

<3030609030609012060901201609013016019040701101507011015019011015020024016020024029090140200260150200

95%可信限下限<5

上限90

<5130

1030230360

3010303070

360

360370

440890

22222222223333333333333333

11222233330000111122223333

23012301230123012301230123

270340210280350420290360440530230390640950430750120016009301500210029002400460011000≥24000

4070150701403001503003503607101500

120013003800210023003800380044004700130002400048000

40100

4701500

注:1本表采用3个稀释度[1mL(g)、0.1mL(g)和0.01mL(g)],每稀释度3管。

2表内所列检样量如各增加10倍时,则表内数字相应降低10倍,如检样量各降低10倍时,则表内数字相应增加10倍,其余可类推。

范文八:粪大肠菌群的测定 投稿:白鋆鋇

粪大肠菌群的测定

1 卫生学意义

粪大肠菌群测定的卫生学意义:一、与大肠菌群相比,粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大,而且在自然界容易死亡。因此,粪大肠菌群的存在表明食品近期内可能直接或间接的受到了粪便的污染;二、作为粪便污染指标评价食品的卫生状况,推断食品中肠道致病菌污染的可能性;三、常用做贝类和贝类养殖用水的卫生指标 。

2 检验方法

2.1 术语与定义

一群在44.5℃培养24h-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

卫生学概念,又称为耐热大肠菌群,主要是大肠杆菌,但也包括克雷伯氏菌属等。

2.2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:

(1)恒温培养箱:36℃±1℃。

(2)冰箱:2℃~5℃。

(3)恒温水浴箱:46℃±1℃。

(4)天平:感量0.1g。

(5)无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。

(6)无菌锥形瓶:容量500mL。

(7)无菌培养皿:直径90mm。

(8)pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

2.3 培养基和试剂

(1)月桂基硫酸盐胰蛋白胨(Lauryl Sulfate Tryptose,LST)肉汤:

1)成分:胰蛋白胨或胰酪胨:20.0g;氯化钠:5.0g;乳糖:5.0g;磷酸氢二钾(K2HPO4):2.75g;磷酸二氢钾(KH2PO4):2.75g;月桂基硫酸钠:0.1g;

蒸馏水:1000mL;pH:6.8±0.2

2)制法:将上述成分溶解于蒸馏水中,调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。

(2)EC肉汤(E.coli,BGLB):

1)成分:胰蛋白胨或胰酪胨:20.0 g;3号胆盐或混合胆盐:1.5 g;乳糖:5.0g;磷酸氢二钾(K2HPO4):4.0g;磷酸二氢钾(KH2PO4):1.5g;氯化钠:5.0g;

蒸馏水:1000mL;pH:6.9±0.1。

2)制法:将上述成分溶于约蒸馏水中,调节pH,分装到有玻璃小导管的试管中,每管8mL,121℃高温灭菌15min。

(3)无菌生理盐水:

1)成分:氯化钠:8.5 g;蒸馏水:1000mL;

2)制法:称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。

2.4 检验程序

2.5 操作步骤

(1)初发酵

选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液。每个稀释度接种三管月桂基磺酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量需要超过1mL,则用双料LST肉汤)。36℃±1℃培养24h±2h,检查倒管内是否有气泡产生或轻摇试管时是否有密集连续的细小气泡从管底逸出,如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为粪大肠菌群阴性;对产气者,则进行复发酵试验。

(2)复发酵

用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于已提前预温至45℃的EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管放入于带盖的44.5℃±0.2℃恒温水浴箱内,水浴的水面应高于肉汤培养基液面,培养24h±2h,记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群阳性,不产气为粪大肠菌群阴性。

注:EC肉汤管在接种之前要提前预温至45℃,因为这个温度是选择性生长的条件之一,如果不提前预温,那些能够在44.5度以下生长的非粪大肠菌群类细菌在培养基的升温阶段就可能已经生长并发酵乳糖产气了。

2.6 结果与报告

证实为粪大肠菌群的阳性管数,

群MPN值。

查(MPN)表, 报告每g(mL)样品中粪大肠菌

范文九:水中大肠菌群的测定 投稿:薛楡楢

实验 水中大肠菌群的测定及结果分析

一、目的要求

1、学习测定水中大肠菌群检测程序、方法。 2、掌握大肠菌群检测结果的报告方式。 二、实验原理

大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标,也是反映水体被生活无水污染的一项重要监测项目。

大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,在37℃生长时,能在48小时发酵乳糖并产酸才产气。食品中大肠菌群数是以每100mL(g)检样内大肠菌群最近似数(The most probable number,简称MPN)表示。据此含义,所有食品卫生标准中所规定的大肠菌群均以100mL(g)食品内允许含有大肠菌群的实际数值为报告标准。检查大肠菌群数,一方面能表明食品中有无粪便污染,另一方面还可以根据数量的多少,判定食品受污染的程度。我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过3个。

多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基,并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖,而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。 三、实验器材

1、培养基:乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵管

2、器皿:1ml吸管、10ml吸管、试管(15×150)、三角锥瓶500ml、三角锥瓶500ml(内装蒸馏水250ml)

3、其他:酒精灯,牛皮纸或报纸,棉花,高压蒸汽菌锅,水浴锅,显微镜,香柏油,二甲苯等 四、操作方法

1、水样的采取

池水、河水或湖水 应取距水面10—15㎝的深层水样,先将灭菌的带玻璃塞瓶,瓶口向下浸入水中,然后翻转过来,除去玻璃塞,水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好,再从水中取出,最好立即检查,否则需放入冰箱中保存。

2、检样稀释

(1)以无菌操作,将检样25mL放于含有225mL灭菌蒸馏水水的三角锥瓶中,摇匀,做成1:10的均匀稀释液。

(2)取一支lmL吸管插入吸取1∶10稀释液1mL注入含有9mL灭菌水的试管内,振摇试管,混合均匀,做成1∶100稀释液。

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(3)另取1ml灭菌吸管按上述操作顺序操作10倍递增稀释液,如此每递增稀释1次,即换用1支1ml灭菌吸管。

(4)根据对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度接种三管。

3、发酵试验

选择三个稀释度分别接种与乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,可用双料乳糖胆盐发酵管;1mL及1mL以下者,可用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管,置于(36±1)℃温箱内,培养(24±2)h ,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行检验。

4、分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置于35~37℃温箱内,培养18~24h,然后取出观察菌落形态、并做革兰氏染色、镜检和乳糖复发酵试验。

5、复发酵证实试验

在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置于(36±1)℃温箱内,培养(24±2)h ,观察产气情况。凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 五、实验报告

填表,并根据实验证实为大肠菌群阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL大肠菌群的最可能数。

被检样品每100mL中大肠菌群细菌的可能数为:

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附表:

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实验安排:

1、在配培养基时,将乳糖胆盐发酵管和乳糖发酵管分别用针注满,沿着试管壁滑入试管中,试管内装有液体培养基,注意不要有气泡,试管分别为每组九个,共18个。试管包扎后灭菌。

2、第二次实验:取水样进行梯度稀释(用无菌水),分别为10、10、10。每个稀释度样分别于接种三个试管(带有导管),即九个试管。培养24h。

3、第三次实验:观察现象(产酸产气)和分离培养。将伊红美蓝培养基做好。将观察到的产酸产气的试管(9个中的)用接种针(环)取样接种于伊红美蓝培养基上(平板),进行培养。

4、第四次实验:在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色。 5、第五次实验:同时接种乳糖发酵管,置于(36±1)℃温箱内,培养(24±2)h,观察产气情况。凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。

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范文十:滤膜法测定总大肠菌群 投稿:韦匑匒

滤膜法测定总大肠菌群

1 主题内容与适用范围

本方法规定了生活饮用水中总大肠菌群的滤膜测定方法。

本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。

2 方法提要

用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样,细菌被截留在滤膜上,将滤膜贴在选择性培养基上,经培养后,计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。

3 培养基与试剂

3.1 品红亚硫酸钠培养基

3.1.1 成份

A 蛋白胨 10g

B 酵母浸膏 5g

C 牛肉膏 5g

D 乳糖 10g

E 琼脂 15~20g

F 硫酸氢二钾 3.5g

G 无水亚硫酸钠 5g左右

H 碱性品红乙醇溶液(50g/L) 20mL

I 蒸馏水 1000mL

3.1.2 储存培养基的制备

先将琼脂加到500mL蒸馏水中,煮沸溶解,于另500mL蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏,加热溶解,倒入已溶解的琼脂,补充蒸馏水至1000mL,混匀后调pH为7.2~7.4,再加入乳糖,分装,115℃高压灭菌20min,储存于冷暗处备用。

3.1.3 平皿培养基的配制

将上法制备的储存培养基加热融化,用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中,再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一灭菌试管中,加灭菌水少许,使其溶解后,置沸水浴中煮沸10min以灭菌。

用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液,滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止,将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内,并充分混匀(防止产生气泡),立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平皿中。待冷却凝固后置冰箱内备

用。此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。如培养基已由淡粉色变为深红色,则不能再用。

3.2 乳糖蛋白胨培养基

3.2.1 成份

A 蛋白胨 10g

B 牛肉膏 3g

C 乳糖 5g

D 氯化钠 5g

E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL

F 蒸馏水 1000mL

3.2.2 制法

将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中,调整pH为7.2~7.4,再加入1mL1.6%溴甲酚紫乙醇溶液,充分混匀,分装于装有倒管的试管中,115℃高压灭菌20min,贮存于冷暗处备用。

4 仪器

4.1 滤器。

4.2 滤膜,孔径0.45~0.65μm。直经根据滤器规格,目前常用的有3.5cm和4.7cm两种。

4.3 抽滤设备。

4.4 无齿镊子。

4.5 培养箱: 36±1℃。

4.6 冰箱: 0~4℃。

4.7 天平。

4.8 显微镜。

4.9 平皿: 直径为9cm。

4.10 灭菌刻度吸管: 1mL,10mL。

5 检验步骤

5.1 准备工作

5.1.1 滤膜灭菌:

将滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中煮沸灭菌三次,每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次,以除去残留溶剂。

5.1.2 滤器灭菌: 用点燃的酒精棉球,火焰灭菌。也可用121℃高压灭菌20min。

5.2 过滤水样

用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗糙面向上,帖放在已灭菌的滤床上、,固定好滤器,将100mL水浴(如水样含菌数较多,可减少过滤水样量,或将水样稀释)注入滤器中,打开滤器阀门,在负0.5大气压下抽滤。

5.3 培养

水样滤完后,再抽气约5s,关上滤器阀门,取下滤器,用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分,移放在品红亚硫酸钠培养基(36.1.3.1)上,滤膜截留细菌面向上,滤膜应与培养基完全贴紧,两者间不得留有气泡,然后将平皿倒置,放入37℃恒温箱内培养22~24h。

6 观察结果

6.1 挑出符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。

紫红色,具有金属光泽的菌落。

深红色,不带或略带金属光泽的菌落。

淡红色,中心色较深的菌落。

6.1.1凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,再接种乳糖蛋白胨培养基液,于37℃培养24h,有产酸产气者,则判定为总大肠菌群阳性。

6.1.2 计算滤膜上生长的总大肠菌群数,以每100mL 水样中的总大肠菌群数报告之(CFU/100mL)

总大肠菌群菌落数(CFU/100mL)=───────────────────────………(36-1)

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