聚丙烯酰胺凝胶电泳_范文大全

聚丙烯酰胺凝胶电泳

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【专家解析】聚丙烯酰胺凝胶电泳

【优秀范文】聚丙烯酰胺凝胶电泳

范文一:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 投稿:廖汭汮

实验目的:测定蛋白质亚基的分子量及纯度

实验原理:在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小,而电荷因素可以被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系,可以用来测定蛋白质亚基的分子量。

基本过程:制胶、电泳、检测

试剂:(储液由专业人员配置)30%丙烯酰胺单体储液、10%过硫酸铵、TEMED、

1.5mol/L Tris-HCl, pH8.8、1.0mol/L Tris-HCl, pH6.8、10%SDS、10XTris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、2Xloading buffer、水饱和正丁醇

器材:灌胶支架、玻璃板、梳子、电源、加热器、电泳槽、扫描仪

实验操作程序:

1.安装灌胶模具,依照说明书进行

2.按照配方配置一定量(7cm模具配置1mm厚的胶配置5ml)的分离胶溶液和浓缩胶溶液(2ml),过硫酸铵和TEMED在用前加入。

3.分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具,上方留约1.5-2cm用于加浓缩胶,小心的在分离胶的表面加一层水饱和正丁醇(或水饱和的异丙醇、水),封住胶面,以促使聚合并保持胶面平整。

4.室温放置40分钟到1小时后,可以看到一个界面,去掉上层覆盖液,用浓缩胶缓冲液淋洗胶面,然后灌制浓缩胶,并插入与模具大小相同,凝胶厚度相当的梳子。

5.静止放置40-60分钟使凝胶聚合,电泳液清洗样品孔。

6.制备好的蛋白质样品用2Xloading buffer 1:1混合,与分子量marker 一起100℃煮3-5min, 12000rpm离心5-10min,(7cm模具、1mm厚度、10孔、考染上样量30ug)

7.加入下槽液,把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽,加入上槽液,上样。

8.连接电源,5-10mA/胶开始电泳,待溴酚蓝前沿到达分离胶后加大电流到10-15mA/胶,

9.溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳,取出凝胶,做好标记,准备染色。

10.染色。见考马斯亮蓝染色操作规程及银染色操作规程。

11.扫描。扫描操作见扫描仪的使用说明。

注意事项

1.在加过硫酸铵和TEMED之前溶液最好抽气,防止溶解在溶液里的分子氧在聚合时产生气泡使胶不均一。

2.过硫酸铵和TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。

3.分离胶聚合后最好在4℃放置12小时后再使用,以使凝胶充分聚合,改善电泳时的分辨率。

4.为防止气泡陷入,梳子应倾斜插入。

5.如果带着梳子过夜可能会影响分辨率,所以浓缩胶最好在使用前再灌制。

6.如果没有足够数目的样品,应在加样孔中加样品缓冲液,不要留有空孔,以防止电泳时邻近的带扩展。

7.对样品浓度不确定的情况下,加样时使用梯度加样法,能大致估计出样品的浓度。

范文二:聚丙烯酰胺凝胶电泳 投稿:邵泲泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

扩增产物中加入5ul甲酰胺loading buffer,混匀后变性(94℃,10min)Marker也要变性,(Marker组分5ulMarker+25ul loading buffer)[Marker:华美PBR322 DNA/mspⅠ]变性结束后立即转移到冰上10min备用。

(1)玻璃板的制备

用钢丝球和洗涤液将玻璃板反复擦洗,然后用清水冲洗干净。待玻璃板干燥后,用餐巾纸蘸95%酒精擦净“凹板”和“平板”,自然干燥,然后在“凹板”上均匀涂抹剥离硅烷(Repel-silance),在“平板”上均匀涂抹亲和硅烷(Binding-silance)。操作过程中防止两块玻璃板相互污染,晾干,洗干净亲和硅烷:1.5ml95%乙醇+10ul冰乙酸+10ul亲和硅烷梳子和压条,擦干,然后把“凹板”盖在“平板”上,用夹子夹好,水平仪检测是否水平。

(2)凝胶的配制

量取60ml 6%聚丙烯酰胺凝胶,加入250ul10%过硫酸铵(AP)和40ul TEMED混匀

(3)灌胶

把胶沿凹板上灌胶口缓慢灌入,要均匀且不能产生气泡,当胶流到玻璃板的底部时,迅速将梳子平端插入平板与凹板之间,刚好过梳子的黄线即可聚合2h。

(4)电泳槽的组装

将凝胶后的凝胶板组装到电泳槽上在正、负极槽中加入1XTBE,将电机导线插好,并检查封条是否密封,预电泳30min(U=2000V,I=200mA,P=100W)预电泳结束后,用注射器吹打凹槽胶孔上的气泡,将梳子水平插入

(5)变性

(6)电泳

点样6ul,V=2000v,I=200mA,P=80W恒功率电泳至第一条loading buffer带至胶板的另一边缘时电泳结束。

(7)电泳结束后,小心卸下胶板,并轻轻将两块玻璃板分开,胶会紧贴在涂有亲和硅烷的平板上。

范文三:聚丙烯酰胺凝胶电泳 投稿:王萈萉

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验简介:在电泳体系中加入十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS),可消除净电荷对样品迁移率的影响,其电泳迁移率主要依赖于被分离物质的分子量大小,这种电泳方法称为SDS-PAGE。由于此方法具有操作方便、分辨率高、样品用量少、重复性好等优点,常用于蛋白质分子量及纯度的测定。

一、实验目的

1、学习并掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的原理与方法。

二、实验原理

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是通过蛋白质和SDS形成复合物后,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中,不同大小分子迁移率不同,达到分离蛋白质的目的。

在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后,巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原,使多肽组分分成单个亚单位;SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开,并结合到蛋白质分子上,形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下,SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS:1g蛋白质。由于SDS带有大量负电荷,当它与蛋白质结合时,消除或掩盖了不同种类蛋白质问原有电荷的差异,使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷。SDS与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明,它们在水溶液中的形状,近似于雪茄烟形的长椭圆棒,不同蛋白质SDS复合物的短轴长度一样,约为18埃,而长轴则随蛋白质的相对分子质量成正比地变化。由于蛋白质的迁移率与蛋白质的净电荷量(q)成正比,与蛋白质在溶液中的摩尔系数(f)成反比(f由介质的粘滞性、蛋白质分子的大小和形状决定),而不同的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷,并具有相同形状;因此在一定浓度的凝胶中,由于分子筛效应,则电泳迁移率就成为蛋白质相对分子质量的函数。

不同的凝胶浓度适用于不同的相对分子质量范围。

可根据所测未知样品的估计相对分子质量范围选择最适凝胶浓度,并尽量选择相对分子质量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。进行

SDS-PAGE时,则可根据已知蛋白质相对分子质量的电泳迁移率和相对分子质量的对数作出标准曲线,再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得相对分子质量。值得指出的是,每次测定未知蛋白质相对分子质量时,都应同时用标准蛋白质制备标准曲线,而不是利用过去的标准曲线。

现在常用的SDS-PAGE系统有好几种,缓冲液系统有连续和不连续之分,凝胶形状可以是柱状,也可以是平板状。本实验采用的是不连续垂直板电泳,此系统分辨率高,便于电泳样品问的相互比较,是目前科研工作中广泛采用的一个系统。

三、实验用品

1、实验材料

标准蛋白质:可采用厂家生产的不同相对分子质量范围的SDS-PAGE标准蛋白质试剂盒,也可参考常用的标准蛋白质相对分子质量表,从中选择3~5种蛋白质,按照每种蛋白0.5~1mg/mL溶解液,自己配制标准蛋白质混合试剂。

2、实验器材

垂直板电泳槽,恒压恒流电泳仪,酸度计,微量进样器(50μL或100μL),注射器(1mL),细长头滴管。

3、实验试剂

(1)凝胶贮液:称丙烯酰胺(Acr)30.0g,甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100mL,置棕色试剂瓶中,4℃贮存。

(2)10%TEMED(V/V):取10mLTEMED,加重蒸水至100mL, 置棕色试剂瓶 中,4℃贮存。

(3)10%过硫酸铵(AP)(W/V):称AP 1.0g,加重蒸水至10mL,当天配制。

(4)分离胶缓冲液(3.0 mol/L pH 8.9 Tris·HCl缓冲液)

(5)浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L pH 6.7 Tris·HCl缓冲液)

(6)染色液:称50mg考马斯亮蓝R-250,加10mL冰醋酸,定容至100mL。

(7)脱色液:10%冰醋酸。

(8)10%(W/V)SDS(AR)溶液:称5 g SDS,加重蒸水至50mL,微热使其溶解,置试剂瓶中,4℃贮存。在低温下易析出结晶,用前微热,使其完全溶解。

(9)电极缓冲液(内含0.1%SDS的Tris·甘氨酸缓冲液,pH 8.3):称Tris 6.0 g,Gly 28 g,加10%SDS 10 mL,加蒸馏水使其溶解后定容至1000 mL。

(10)样品溶解液:内含1%SDS,1%巯基乙醇,40%蔗糖或20%甘油,0.02%溴酚蓝,0.01 mol/L pH 6.7 Tris·HCl缓冲液。(如样品为液体,则应配制2倍样品溶解液,使样品溶解液浓度大一倍,然后等体积混合)

四、实验操作

(1)安装夹心式垂直板电泳槽

用细长头滴管吸取已熔化的1%琼脂溶液,封住长玻璃板下端与硅胶模间的缝隙。加琼脂溶液时应防止气泡进入。

(2)配胶

根据所测蛋白质相对分子质量范围,选择适宜的分离胶浓度。按表2的配制方法进行配制。

(3)凝胶板的制作

将混合后的分离胶溶液,用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内,加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3~4 mm),用于隔绝空气,使胶面平整。约30 min后,可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线,则表明凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水,用滤纸条吸去多余的水,但不要碰破胶面。用细长头的滴管将混合均匀的浓缩胶加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)距短玻璃上缘0.5 cm处,轻轻加入样品槽模板。静置电泳槽,10 min左右上胶即可聚合,再放置10~20 min,加入pH 8.3的Tris·甘氨酸电极缓冲液,使液面没过短玻璃板约0.5 cm,轻轻取出样品槽模板,即可加样。

(4)样品的处理

根据标准相对分子质量蛋白试剂盒的要求加样品溶解液,自己配制的标准及未知样品,按0.5~1mg/mL加样品溶解液,溶解后,将其转移到带塞的小离心管中,轻轻盖上盖子(不要塞紧,以免加热时进出),在100℃沸水浴中加热3 min,取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用,可放在-20℃冰箱保存较长时间,使用前在100℃沸水浴中加热3min,以除去亚稳态聚合。

(5)加样

加样的体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握,一般加样体积为 10~15μL(即2~10μg蛋白),若样品较稀,加样体积可达100μL ,但注意样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡,如有气泡,可用注射器针头挑除。加样时,将微量进样器的针头通过电极缓冲液伸人加样槽内,尽量接近底部,注意针头不要碰破凹槽胶面,轻轻加入样品。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油,因此样品溶解液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。

(6)电泳

将电泳仪的正极与下槽连接,负极与上槽连接,接通冷却水,打开电泳仪开关,开始时电流为10 mA,待样品进入分离胶后,将电流调至20~30 mA,当溴酚蓝染料距硅胶框1cm时,停止电泳,关闭电源及冷却水。

(7)染色与脱色

电泳结束后,取下凝胶模,卸下硅胶框,用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板,从凝胶板上切下一角作为加样标记,在两侧溴酚蓝染料区带中心,插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放入大培养皿中,加入染色液染色1~2 h,用蒸馏水漂洗数次,再用脱色液脱色,直至蛋白质区带清晰,即可计算相对迁移率。

(8)绘制标准曲线

将大培养皿放在一张坐标纸上,量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm),按下式计算相对迁移率MR: 相对迁移率MR =蛋白质样品距加样端迁移距离/cm 溴酚蓝区带中心距加样端距离/cm

五、结果

以标准蛋白的相对迁移率为横坐标,标准蛋白质相对分子质量为纵坐标在半对数坐标纸上作图,可得到一条标准曲线。根据未知蛋白质样品相对迁移率可直接从标准曲线上查出其相对分子质量。

六、注意事项

1、SDS-PAGE有不足之处,尤其是电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白(如糖蛋白)及一些结构蛋白等测出的相对分子质量不太可靠。因此要确定某种蛋白质的相对分子质量时,最好用2种以上的测定方法互相验证。

2、在SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量还需要注意以下问题:如果SDS-蛋白质复合物不能达到1.4g SDS:1g蛋白质的比率并具有相同的构象,就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素主要有3个:①二硫键是否完全被还原:只有在蛋白质分子内二硫键被彻底还原的情况下,SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去,并使之具有相同的构象。②溶液中SDS的浓度:溶液中SDS的总量至少要比蛋白质的高3倍,一般常高达10倍以上。③溶液的离子强度:溶液的离子强度应较低,最高不超过0.26。因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在,SDS结合到蛋白质分子上的量,仅取决于平衡时SDS单

体的浓度而不是总浓度,在低离子强度的溶液中,SDS单体具有较高的平衡浓度。

七、作业

1、简述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定相对分子质量的原理

2、是否所有的蛋白质用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定得到的相对分子质量都完全可靠?

参考文献

林加涵等,现代生物学实验(下册),北京:高等教育出版社,2002.

(陈彦)

范文四:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 投稿:雷羨義

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

王宏王晓彤王雨琪魏鹏羽

1.实验仪器

微型凝胶电泳装置,电源(电压200v,电流500mA),100℃沸水浴,Eppendorf管,微量注射器(50μL或100μL),干燥器、真空泵或水泵,带盖的玻璃或塑料小容器,摇床。

2.实验试剂

(1)1mol/LTris-HCl(pH6.8):取6.05gTris,加40mL蒸馏水,缓慢加浓盐酸至pH6.8,让溶液冷却至室温,加蒸馏水10mL。

(2)2mol/LTris-HCl(pH8.8):取12.1gTris,加40mL蒸馏水,缓慢加浓盐酸至pH8.8,让溶液冷却至室温,pH将升高,加蒸馏水至于50mL。

(3)10%(w/v)SDS:取5gSDS,加蒸馏水至50mL

(4)50%(v/v)甘油:取25ml100%甘油,加蒸馏水至25mL。(已有)

(5)1%(w/v)溴酚蓝:取100mg溴酚蓝,加蒸馏水至10mL。(已有)

(6)10%过硫酸铵:取0.5g过硫酸铵,加入5mL蒸馏水,可保存在密封管内。最好当天配制,在冰箱中贮存也不可能超过一个星期。

(7)电泳缓冲液:取14.4g甘氨酸,5gSDS,加蒸馏水至5L,逐渐加入Tris,调节pH约为8.3,也可配制成10X的储备夜,在室温下长期保存。

(8)5X样品缓冲液:1mol/LTris-HCl(pH6.8)取0.6mL加2mL10%SDS,5mL50%甘油,0.5mL2-疏基乙醇,1mL1%溴酚蓝,0.9mL蒸馏水混匀,可在4℃保存数周,或在-20℃保存数月。(已有)

范文五:聚丙烯酰胺凝胶电泳是什么 投稿:冯酫酬

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。

聚丙烯酰胺凝胶有以下优点:

①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N,N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有

格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物,没有或很少带有离子的侧基,因而电渗作用比较小,不易和样品相互作用。

②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质,在聚合前可调节单体的浓度比,形成 不同程度交链结构,其空隙度可在一个较广的范围内变化,可以根据要分离物质分子 的大小,选择合适的凝胶成分,使之既有适宜的空隙度,又有比较好的机械性质。一 般说来,含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶,机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物 质,1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶,而分子量特别大的可采用含 丙烯酰胺4%的凝胶,大孔胶易碎,小孔胶则难从管中取出,因此当丙烯酰胺的浓度增 加时可以减少双含丙烯酰胺,以改进凝胶的机械性能。

③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明,易观察,可用检测仪直接测定。 ④丙烯酰胺是比较纯的化合物,可以精制,减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体,甲撑双

丙烯酰胺称交联剂,在水溶液中,单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝 胶。 在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中,需要有催化剂参加,催化剂包括引发剂和 另速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基,通过自由基的传递,使丙烯酰胺 成为自由基,发动聚合反应,加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。常用的引发剂 和加速剂的配伍如下表:

聚合反应催化剂配伍

引 发 剂 加 速 剂

(NH4)2S2O8 TEMED

(NH4)2S2O8DMAPN

核 黄 素 TEMED

注:(NH4)2S2O8,过硫酸胺 TEMED:N,N,N,N';四甲基乙二胺 DMAPN:β-二甲基胺基丙晴

用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应;用核黄素引发,需要强光照射反应液, 称光聚合反应。 聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素影响:

1、大气中氧能淬灭自由基,使聚合反应终止,所以在聚合过程中要使反应液与空气 隔绝。 2、某些材料如有机玻璃,能抑制聚合反应。

3、某些化学药物可以减慢反应速度,如赤血盐。 4、温度高聚合快,温度低聚合慢。 以上几点在制备凝胶时必须加以注意。

凝胶的筛孔,机械强度及透明度等很大程度上由凝胶的浓度和交联决定。每100亳升 凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度,常用T%表达;凝胶溶液中交联剂 占单体和交联体总量的百分数称为交联度,常用C%表示,可用下式计算:

公 式

a:丙烯酰胺克数; b:甲撑双丙烯酰胺克数;m:缓冲液体积(毫升)

凝胶浓度过高时,凝胶硬而脆,容易破碎;凝胶浓度太低时,凝胶稀软,不易操作。 交联度过高,胶不透明并缺乏弹性;交联度过低,凝胶呈糊状。 聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度,它不防止对流减低扩散的能力,而且因为它具有三

度空间网状结构,某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大 小和形状,这是凝胶的分子筛作用。由于这种分子筛作用,这里的凝胶并不仅是单纯 的支持物,因此,在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外,还必须注意与凝胶本 身有关的各种性质(网孔的大小和形状等)。可通过下式计算来选择适当的凝胶网 孔。 公 式

式中:P为网孔平均直径,C为多聚体浓度,d为该多聚体分子直径(若不是卷曲的分 子应为5A),K为常数,K值取决于涨胶的几何构型,假如多聚体的链是以近似于直角 交联的,则约为1.5根据此式,我们可以通过多聚体浓度C近似地计算出网孔直径,例 如已知多聚体浓度为5%,其网孔平均直径应为:

公 式

这样的计算是粗略的,与实际情况有一定距离,有人测定了总浓度(T)为20%的丙烯酰胺液,在六种不同比例的双丙烯酰胺存在

下,聚合后的网孔大小,发现孔径与总浓度有关,总浓度愈大,孔径相应变小,机械 强度增强,与总浓度不变时,甲叉双丙烯酰胺(Bis)的浓度在5%时孔径最小,高于或 低于此值时,聚合体孔径都相对变大,凝胶孔径在凝胶电泳中是一个重要的参数,它

往往决定了电泳的分离效果。经过不断的实践,得到了如表3所示的经验值,在一般情况下,大多数生物体内的蛋白质采用7.5%浓

度的凝胶,所得电泳结果往往是满意的,因此称由此浓度组成的凝胶为“标准凝 胶”。 对那些用于重要研究的凝胶,最好是通过采用10%的一系列凝胶浓度梯进行预先试验,以选

出最适凝胶浓度。

网址:www.pam8.com

原文地址:http://www.pam8.com/mod_article-article_content-article_id-175.html

范文六:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 投稿:石糚糛

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳:莱姆利(U.K.Laemmli)于1970年创建的含十二烷基硫酸钠(SDS)的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质方法。向样品加入还原剂(打开蛋白质的二硫键)和过量SDS,SDS是阴离子去垢剂,使蛋白质变性解聚,并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物,掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异,使各种蛋白质的电荷/质量比值都相同,因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。是分析蛋白质和多肽、测定其分子量等常用的方法。可测定蛋白质分子量.其原理是带大量电荷的SDS结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷/质比.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功,此法测定时间短,分辨率高,所需样品量极少(1~100μg),但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质,某些蛋白质不易与SDS结合如木瓜蛋白酶,核糖核酸酶等,此时测定结果就不准确.

2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

(1)定义

􀁚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠)

(2)SDS的作用

SDS是一种阴离子去垢剂,可与蛋白质结合,形成SDS-蛋白质复合物。􀄱于SDS带有大量负电荷,好比蛋白质穿上带负电的“外衣”,蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。􀋠此在电泳时,蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小

(3) SDS-PAGE分类:

SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类: 连续系统:电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统:缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度均不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳

(4)聚丙烯胺凝胶的生成:

聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体(Acr)和N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时,Acr和Bis就会聚合。

引发产生自由基的方法有两种:

①化学法

②光聚合法

①化学聚合:

引发剂是过硫酸铵(AP),催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺(TEMED),它的碱基催化AP产生氧自由基,激活单体形成自由基,发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径较小,且重复性好,用来制备分离胶;

②光聚合:

催化剂是核黄素(VB2),在痕量氧存在下,核黄素光解形成无色基,无色基再

被氧氧化成自由基,激活单体发生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大,且不稳定,适于制备大孔径的浓缩胶。

电泳后结果检测

对于不同的目的,应采用不同的检测方法.用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法.

(七)聚丙烯酰胺凝胶电泳结果不正常现象和对策 1. 指示剂前沿呈现两边向上或向下的现象.向上的

2.

3.

4. 蛋白带偏斜常常是由于滤纸条或电极放置不平行所引起的,或由于加样位置偏斜而引起.

5. 蛋白带过宽,与邻近蛋白泳道的蛋白带相连,这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的.

6. 蛋白带模糊不清和分辨不佳是由于多种原因引起的.虽然梯度凝胶可以提高分辨率,但与其他方法相比,常规聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨率较低的方法.为了提高分辨率,不要加过多的样品,小体积样品可给出窄带.加样后应立即电泳,以防止扩散.选择合适的凝胶浓度,使组分得以充分的分离.通常靠近前沿的蛋白带分辨率不佳,所以应根据分子量与凝胶孔径的关系,灌制足够长度的凝胶,以使样品不会走出前沿.样品的蛋白水解作用也引起扩散而使分辨率降低.水解作用通常发生在样品准备的时候,系统中的内源性蛋白酶会水解样品蛋白,如果在缓冲液中加蛋白酶抑制剂可以减少这种情况的发生.

常见问题及分析

1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响?

在SDS-PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压梯度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈

碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。

2. 样品如何处理?

根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1)还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样。

2)带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺,并在室温保温30min。

3)非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。

3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用?

聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;

制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris-HCL系统,TEMED与AP:AP提供自由基,TEMED是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行;十二烷基硫酸钠(SDS):阳离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径?

聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

5.“ 微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因?

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。 处理办法:待其充分凝固再作后续实验。

6. “皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因?

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。

7. 为什么带出现拖尾现象?

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲

液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。

8. 为什么带出现纹理现象?

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。

9. 什么是“鬼带”,如何处理?

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用?

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。

11. 为什么电泳的条带很粗?

电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。

处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压;

12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢?

这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上,可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。

处理办法:电泳槽正确装配即可。

13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗?

这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的。

14. 凝胶时间不对,或慢或快,怎么回事?

通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用,TEMED不稳定,易被氧化成黄色。 如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。

15. 电泳时间比正常要长?

可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。

范文七:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 投稿:张叾叿

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验目的:测定蛋白质亚基的分子量及纯度

实验原理:在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白

质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小,而电荷因素可以

被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时,电泳迁移率

与分子量的对数呈线性关系,可以用来测定蛋白质亚基的分子量。

基本过程:制胶、电泳、检测

试剂:(储液由专业人员配置)30%丙烯酰胺单体储液、10%过硫酸铵、TEMED、

1.5mol/L Tris-HCl, pH8.8、1.0mol/L Tris-HCl, pH6.8、10%SDS、10XTris-甘氨酸

系统的电泳缓冲液、2Xloading buffer、水饱和正丁醇

器材:灌胶支架、玻璃板、梳子、电源、加热器、电泳槽、扫描仪

实验操作程序:

1.安装灌胶模具,依照说明书进行

2.按照配方配置一定量(7cm模具配置1mm厚的胶配置5ml)的分离胶溶液和

浓缩胶溶液(2ml),过硫酸铵和TEMED在用前加入。

3.分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具,上方留约1.5-2cm用于加浓缩

胶,小心的在分离胶的表面加一层水饱和正丁醇(或水饱和的异丙醇、水),

封住胶面,以促使聚合并保持胶面平整。

4.室温放置40分钟到1小时后,可以看到一个界面,去掉上层覆盖液,用浓缩

胶缓冲液淋洗胶面,然后灌制浓缩胶,并插入与模具大小相同,凝胶厚度相

当的梳子。

5.静止放置40-60分钟使凝胶聚合,电泳液清洗样品孔。

6.制备好的蛋白质样品用2Xloading buffer 1:1混合,与分子量marker 一起

100℃煮3-5min, 12000rpm离心5-10min,(7cm模具、1mm厚度、10孔、考

染上样量30ug)

7.加入下槽液,把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽,加入上槽液,上样。

8.连接电源,5-10mA/胶开始电泳,待溴酚蓝前沿到达分离胶后加大电流到

10-15mA/胶,

9.溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳,取出凝胶,做好标记,准备染色。

10.

11.

注意事项

1.在加过硫酸铵和TEMED之前溶液最好抽气,防止溶解在溶液里的分子氧在

聚合时产生气泡使胶不均一。

2.过硫酸铵和TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。

3.分离胶聚合后最好在4℃放置12小时后再使用,以使凝胶充分聚合,改善电

泳时的分辨率。

4.为防止气泡陷入,梳子应倾斜插入。

5.如果带着梳子过夜可能会影响分辨率,所以浓缩胶最好在使用前再灌制。

6.如果没有足够数目的样品,应在加样孔中加样品缓冲液,不要留有空孔,以

防止电泳时邻近的带扩展。

7.对样品浓度不确定的情况下,加样时使用梯度加样法,能大致估计出样品的

浓度。

参考文献:

1.《蛋白质电泳实验技术》郭尧君编著

染色。见考马斯亮蓝染色操作规程及银染色操作规程。 扫描。扫描操作见扫描仪的使用说明。

固相pH梯度-SDS双向凝胶电泳实验操作程序

实验目的:分离蛋白质混合物,将样品进行电泳后,为了不同目的在它的直角方

向再进行一次电泳。常说的双向电泳是根据蛋白质所带的电荷和分子大小对蛋白

质混合物进行分离。

实验原理:第一向等电聚焦的基本原理是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电

点不同,在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。

第二向运用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳根据分子量大小对蛋白质进行分离。

基本过程:等电聚焦、平衡及转移到二向、SDS-PAGE

试剂或储液:IPG buffer、矿物油、DTT、碘代乙酰胺、过硫酸铵、TEMED、1M

DTT、rehydration buffer、平衡液储液、30%丙烯酰胺单体储液、1.5M Tris-HCl、

10% SDS、10X Tris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、0.5%琼脂糖、水饱和正丁醇、占

位液

实验操作程序:

等点聚焦部分

1.根据选用的胶条的长度计算上样体积(见附1),加1M DTT到终浓度50mM

需要的体积,补加IPG buffer到终浓度0.2%或者0.5%的体积,加rehydration

buffer到该胶条的上样体积。

2.把各种溶液按计算的体积加入到eppendorf管中,充分混匀,(或者超声

5-10min)14000rpm,10℃离心5min。

3.取出胶条室温放置10min,平衡胶条的温度。

4.沿着聚焦盘中槽的边缘从左至右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加

样,中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡,否则影响到胶条中蛋

白质的分布。

5.当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG

胶条上的保护层。

6.分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上,

使得胶条的正极(标有+,安玛西亚胶条为尖端)对应于聚焦盘的正极(安玛

西亚为尖端)。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑

料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的

溶液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移

动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。

7.在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发析出尿素。

需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

8.对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序(见附2)。

9.聚焦结束的胶条立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条吸干矿物

油置于平衡管中,-80℃冰箱保存。

注意事项:

参见“双向电泳培训班讲义(定稿)”中等电聚焦注意事项部分。

附1:

胶条长度、上样量、上样体积、等点聚焦的伏小时数的设置及说明

说明:

1.pH3-10NL, pH4-7, pH6-11的上样量与pH 3-10相比增加1.5-2倍,聚焦伏小时

数延长约10000VHr

2.按照推荐量上预实验,根据预实验结果调整上样量,样品中蛋白质分布均匀

按推荐量使用,如果有高丰度的蛋白质适当降低上样量,如果显得少则适当加大

上样量。聚焦的伏小时数可以根据聚焦的情况进行调整。

附2:

等电聚焦程序的设置及说明

rehydration at 20℃ 4-8Hr

S1 50V 8-4Hr 快速

S2 500V 1Hr 快速

S3 1000V 1Hr 快速

S4 8000V 1-2Hr 线性

S5 8000V 见附1 快速

说明:

1.一般无电压泡胀与低电压50V泡胀的时间加起来为12Hrs,无电压泡胀能够

使小分子蛋白进入胶内,低电压泡胀能够使大分子量蛋白容易进入胶内。依

据感兴趣的蛋白质的分子量范围进行调节。

2.样品含盐量高时,最好把S4设置的时间再延长一些,或者在电极上加湿润滤

纸条搭盐桥,避免烧胶。

3.7cm的胶使用最高电压4000V来进行等电聚焦,如果某些样品达不到设置的

8000V/Hr,总伏小时数能够达到设置值也表明等电聚焦已经完成。

4.如果等电聚焦完成与转二向之间有几个小时的间隔,可以设置500V的电压

来保持蛋白在胶里保持溶解状态。

平衡及SDS-PAGE

1.安装灌胶模具,配置SDS凝胶。具体操作见SDS-PAGE、ETTAN DALT II

System 以及ETTAN DALT SIX 操作规程。

2.拿出适量平衡液融化平分到平衡管中,一半加入1% DTT,一半加入2.5%碘

代乙酰胺,充分溶解。

3.等电聚焦完成后,关掉电源,用镊子夹出胶条,胶面朝上放在湿润的滤纸上。

另外一张湿润的滤纸覆盖在胶面上,轻轻吸去上面的油。

4.胶条支持膜紧贴平衡管壁放进含DTT的平衡液中进行还原,低速摇床上放置

15min,把胶条取出来转入含碘代乙酰胺的平衡管中,烷基化打开的二硫键,

低速摇床上放置15min。

5.小心将已平衡好的第一向胶条放置在胶面上,支持膜紧贴长玻板,轻轻压紧,

胶条与胶面之间不要有气泡,胶条一端(一般为碱端)加入分子量marker,

覆盖一层0.5%琼脂糖固定胶条。

6.电泳及染色。见SDS-PAGE、ETTAN DALT II System 以及ETTAN DALT SIX

操作规程。

注意事项:

剥胶后要注意切角以方便辨别。

常见问题及解决方案:

1. 参考文献1 p37-41

2. 参考文献2 p42-44

3. 参考文献3 p283-286

4. 参考文献5 p4-6,p7,p8

参考文献:(参考文献1-3在//bpi-server\ public\references\NEW\reference\by project\

双向电泳文件夹下)

1. 2-D Electrophoresis using Immobilized pH gradients, principles and methods,安

玛西亚公司操作手册

2. 2-D Electrophoresis for Proteomics:A Methods and Product Manual. bio-rad公司

操作手册

3. Proteomics in Practice. Dr. Reiner Westermeier, Dr. Tom Naven。

Wiley-VCH Verlag GmbH

4.《肿瘤蛋白质组学》陈主初、梁宋平主编 湖南科学技术出版社

5.双向电泳培训班讲义(定稿)

6.《蛋白质电泳实验技术》郭尧君编著

Western blotting Protocol

一、 试剂配方:

1X TBS: Tris-base 12.11g

Nacl 8.775g

用HCl 调pH7.4,用纯水稀释至1L

5X Transfer buffer: Tris-base 15.1g

Glycine 72.0g

To 1 L

10X碱性磷酸酶缓冲液: 1 mol/L Tris-HCl pH 9.5

1 mol/L Nacl

50mmol/L MgCl2

TTBS:1XTBS +TWEEN20(1000:1)

碱性磷酸酶显色液:2.5mL 1X碱性磷酸酶缓冲液+16.5µL NBT混匀, 再加

8.25µL BCIP混匀。

辣根过氧化物酶显色液:10 mL 0.01 mol/L pH 7.6 Tris-HCl 溶解 6mg

DAB,滤纸过滤(-20℃保存),显色时加10µL 30%H2O2

(即按1000:1加)。

二、实验操作:

1、SDS-PAGE,胶在电转液:1 X Transfer buffer + 20%甲醇+ 0.01%SDS

(800mL/800µL 10% SDS) 平衡10min。

2、处理尼龙膜:100%甲醇浸泡5min,再加4倍体积的双蒸水,使甲醇终浓度为

20%,浸泡5min。1 X Transfer buffer+20%甲醇(无SDS)浸泡10min。

3、转膜:按黑(—极)—海绵—滤纸—胶—膜—滤纸—海绵—白夹子(+极),

(在电转液:1 X Transfer buffer+20%甲醇+0.01%SDS(800mL/800µL 10% SDS)

中进行)夹好三明志夹,用冰包裹电泳槽,100V 或350mA转70 min。(注

意底部靠其下槽,排除气泡,转完后切角作标记)。

4、封闭:电转后膜用1XTBS漂洗1次,置于5%脱脂奶粉中(1XTBS+1000:1

TWEEN20),封闭过夜,或者37℃,30 min ~90 min。

5、一抗:抗体(抗体稀释比例根据自身实验具体确定,推荐比例:抗血清常用

1:100~1:5000 5%牛奶,培养液上清1:2~1:100,腹水1:200~1:10000 5%牛奶,),震荡孵育1或2小时。(一抗可回收冷冻保存)

6、TTBS洗三次,10 min/次。

7、二抗:1:1000~5000 TTBS稀释(常用1:3000),室温震荡孵育1小时。

8、TTBS洗三次,10 min/次。

9、显色:将膜放在PARAFILM膜上,滴加显色液5rpm(一般显色1 min即可,

注意控制好时间,否则显色背景过深)。

10、纯水终止显色,晾干或滤纸吸干保存。

考马斯亮蓝染色操作规程

实验目的:聚丙烯酰胺凝胶上蛋白质的显色

实验原理:考马斯亮蓝染料能与蛋白质的碱性氨基酸结合形成较稳定的复合物形

式从而使蛋白质显色。

试剂:固定液、染色液、脱色液

实验操作程序:

1.聚丙烯酰胺凝胶取下来后放置到盛有固定液的盘子里,摇床上轻摇固定

30min;

2.倒掉固定液,加入染色液,摇床上轻摇染色过夜或者37℃保温2-3Hrs;

3.到掉染色液,加入脱色液脱色至点或条带清晰明亮,背景干净。

银染操作规程

实验目的:检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。

实验原理:在碱性条件下,用甲醛将蛋白带上的硝酸银(银离子)还原成金属银,以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关,不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还不是非常清楚。

试剂:乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛

实验操作程序:

 固定:30min或者更长时间

o

o

o 100ml 乙醇 40% 乙醇 25ml冰醋酸 10% 冰醋酸 加水到250ml

 致敏:30min

o

o

o

o 75ml 乙醇 30% 乙醇 17g 乙酸钠 28.2g 三水乙酸钠 0.5g硫代硫酸钠 加水到终体积250ml

 水洗:3 x 10min 银染:20min

o

o

o 0.625g AgNO3 100 ul 37%甲醛 加水到终体积250ml

 水洗: 2 x 1 min (注意把握时间,水洗时间长显色速度慢,点的颜色偏

黄色)

 显色:视情况而定

Electrophoresis and Staining SOP

o

o

o 6.25 g Na2CO3 50 ul 37% 甲醛 加水到终体积250ml

 终止:10min

o

o 3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸 加水到终体积250ml

 保存:1% 冰醋酸,4 ℃

注意事项:

1.固定时间较长,则加一步水洗30min,以免胶太脆而破碎。

2.甲醛在使用前加入。

3. 最好多配制一份显色液,第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液,显色到

点清晰。

4. 显色过程很快,要注意把握时间,避免染色过度。

- 11 -

范文八:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 投稿:马斜斝

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

王宏王晓彤王雨琪魏鹏羽

1.实验仪器

微型凝胶电泳装置,电源(电压200v,电流500mA),100℃沸水浴,Eppendorf管,微量注射器(50μL或100μL),干燥器、真空泵或水泵,带盖的玻璃或塑料小容器,摇床。2.实验试剂(1)1mol/L

Tris-HCl(pH6.8):取6.05gTris,加40mL蒸馏水,缓慢加浓盐酸至

pH6.8,让溶液冷却至室温,加蒸馏水10mL。(2)2mol/L

Tris-HCl(pH8.8):取12.1gTris,加40mL蒸馏水,缓慢加浓盐酸至

pH8.8,让溶液冷却至室温,pH将升高,加蒸馏水至于50mL。(3)10%(w/v)SDS:取5gSDS,加蒸馏水至50mL

(4)50%(v/v)甘油:取25ml100%甘油,加蒸馏水至25mL。(已有)(5)1%(w/v)溴酚蓝:取100mg溴酚蓝,加蒸馏水至10mL。(已有)

(6)10%过硫酸铵:取0.5g过硫酸铵,加入5mL蒸馏水,可保存在密封管内。最好当天配制,在冰箱中贮存也不可能超过一个星期。

(7)电泳缓冲液:取14.4g甘氨酸,5gSDS,加蒸馏水至5L,逐渐加入Tris,调节pH约为8.3,也可配制成10X的储备夜,在室温下长期保存。

(8)5X样品缓冲液:1mol/LTris-HCl(pH6.8)取0.6mL加2mL10%SDS,5mL50%甘油,0.5mL2-疏基乙醇,1mL1%溴酚蓝,0.9mL蒸馏水混匀,可在4℃保存数周,或在-20℃保存数月。(已有)

(9)考马斯亮蓝染液:1.0g考马斯亮蓝R-250,加入450mL乙醇,450mL蒸馏水及100mL冰醋酸即成。

(10)考马斯亮蓝洗脱液:将100mL甲醇,100mL冰醋酸,800mL蒸馏水混匀备用。3.实验操作1.灌制封口胶名称

30%聚丙烯酰胺2MTris-HCl

10%Aps(过硫酸铵)TEMED2.灌制分离胶

(1)组装凝胶模具:对于Bio-Rad的微型凝胶电泳系统,在上紧螺丝前,必须确保凝胶玻璃板和隔片的底部与一个平滑的表面紧密接触,有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。

(2)配制分离胶(12.5%分离胶)所用胶为1.0mm名称蒸馏水

30%聚丙烯酰胺2MTris-HCl

10%APS(过硫酰胺)10%SDS

体积3.96ml4.8ml3.0ml120μl120μl体积1.0ml1.0ml80μl8μl

TEMED12μl

(3)当加入适量的分离胶溶液时(对于小凝胶,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm),轻轻在分离胶上覆盖一层1mm-5mm的水层,这使凝胶表面变得平整。当凝胶聚合后,在分离胶和水层之间会出现一个清晰的界面。3.灌制浓缩胶

(1)吸尽覆盖在分离胶上的水(2)配制浓缩胶名称蒸馏水

30%聚丙烯酰胺2MTris-HCl(pH8.8)10%APS(过硫酸铵)10%SDSTEMED

体积3.15ml0.75ml0.57ml80μl45μl6μl

(3)将浓缩胶溶液用吸管加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。将梳子插入凝胶内,直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确保梳子齿的末端没有气泡。将梳子稍微倾斜插入可以减少气泡的产生。

(4)凝胶聚合后,小心的拔出梳子,不要将加样孔撕裂。将凝胶放入电泳槽内,如果使用Bio-Rad的微型凝胶系统,可预先接好电极。将电泳缓冲液加入内外电泳槽中,使凝胶的上下两端均能浸泡在缓冲液中。4.制备样品和上样

(1)将20μl蛋白质样品与5×样品缓冲液(5μl或20μl)在一个Eppendorf管中混合。100℃加热5分钟,离心10s,如果有大量的蛋白质碎片则应延长离心时间。

(2)用微量注射器将样品加入样品孔中,将蛋白质样品加至样品孔底部,并随着染料水平的升高而升高注射器针头。避免带入气泡,气泡易使样品混入到相邻的加样孔中。5.电泳

(1)将电泳插头与适当的电极相接,电流流向阳极。将电压调到110v(保持恒压;对于两块1.0mm的胶来说,电流一开始为11mA,在电泳结束时应为22mA)。

(2)对于两块1.0mm的凝胶,染料的前沿迁移至凝胶的底部约需要3~4小时,关闭电源,从电极上拔掉电极插头,取出凝胶玻璃板,小心移动两玻璃板之间的隔片,将其插入两块玻璃板的一角,轻轻敲开玻璃板,凝胶便会贴在其中一块板上。

6.考马斯亮蓝染色

这种染色方法在单条电泳带中蛋白质最小检出量为0.1μl的蛋白。通常可以根据所需要的敏感度来选择是使用考马斯亮蓝还是银染色。

(1)戴上手套避免将手指印留在电泳凝胶上,将凝胶移入一个小的有少量考马斯亮蓝(20ml足够)的容器内(小心不要将胶撕破)。或将玻璃连同凝胶浸在染料中。

(2)本实验需要染色3小时,在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜封闭容器口。倒除染液,将凝胶在水中漂洗数次。戴手套防止手染色。

(3)加入考马斯亮蓝脱色液(约50ml),清晰的条带很快会显现出来,大部分凝胶脱色需要1h,用过的脱色液则可用水直接冲洗掉。如果要脱色完全,需要数次更换脱色液并振过夜。

范文九:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 投稿:孙孳孴

实 验 九

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)

学时:9

一、实验目的:

1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理; 2.掌握垂直板电泳的操作方法。

二、实验原理: 1、电泳: (1)定义:是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷

相反的电极方向移动的现象。

(2)影响电泳效果的因素:

①带电颗粒的大小和形状:

颗粒越大,电泳速度越慢,反之越快;

②颗粒的电荷数:

电荷越少,电泳速度越慢,反之越快;

③溶液的粘度:

粘度越大,电泳速度越慢,反之越快;

(2)影响电泳效果的因素:

④溶液的pH值: 影响被分离物质的解离度,离等电点越近,电泳速度 越慢,反之越快; ⑤电场强度: 电场强度越小,电泳速度越慢,反之越快; ⑥离子强度: 离子强度越大,电泳速度越慢,反之越快; ⑦电渗现象: 电场中,液体相对于固体支持物的相对移动; ⑧支持物筛孔大小: 孔径小,电泳速度慢,反之则快。

2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

(1)定义

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):是以聚丙烯胺凝 胶作为载体的一种区带电泳。 SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS (十二烷基磺酸钠)

(2)SDS的作用

SDS是一种阴离子去垢剂,可与蛋白质结合,形成SDS-蛋 白质复合物。 由于SDS带有大量负电荷,好比蛋白质穿上带负电的“外 衣”,蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分 子之间电荷差异。 因此在电泳时,蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白 质分子大小

(3) SDS-PAGE分类:

SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续 系统和不连续系统两大类:

连续系统:电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带 电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统:缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯 度均不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应, 分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度 及分辨率均较前者佳

(4)聚丙烯胺凝胶的生成:

聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体(Acr)和N,N’-甲叉 双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合而成。在具有 自由基时,Acr和Bis就会聚合。 引发产生自由基的方法有两种:

①化学法 ②光聚合法

①化学聚合: 引发剂是过硫酸铵(AP),催化剂N、N、N’、N’-四甲 基乙二胺(TEMED),它的碱基催化AP产生氧自由基,激 活单体形成自由基,发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径 较小,且重复性好,用来制备分离胶; ②光聚合: 催化剂是核黄素(VB2),在痕量氧存在下,核黄素光 解形成无色基,无色基再被氧氧化成自由基,激活单体发 生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大,且不稳定

,适于制 备大孔径的浓缩胶。

■ 聚合反应:

EX¤ 应

free radical

Bis

错连结 Bis

°ò§ ¨

(5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点:

① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链,链与链之间通过甲叉桥联结在一起; ② 链的纵横交错形成三维网状结构,使凝胶具有分 子筛的性质; ③ 网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动,使 凝胶具有抗对流的作用; ④ 长链富含酰胺基团,使其成为稳定的亲水凝胶; ⑤ 该结构不带电荷,在电场中电渗现象极为微小。

(6)凝胶的质量决定因素:

(1)凝胶度:

是指100mg凝胶溶液中含有单体(Acr)和交联剂 (Bis)的总克数,用T%表示。

(2)交联度:

是指凝胶溶液中,交联剂占单体和交联剂总量的 百分数,用C%表示。 一般浓缩胶的浓度为7.5%,分离胶的浓度为10%。

聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和 孔径大小均取决于两个重要参数T(总百分浓度)和 C(交联百分浓度)。

b a+b × 100 (%) T= × 100 (%) C = a+ b m

上式中:a为丙烯酰胺的克数,b为甲叉双丙烯酰胺的克数,m为缓 冲液体积(ml)。

当C保持恒定时,凝胶的有效孔径随着T的增加而减小,当T保 持恒定,C为4%时,有效孔径最小,C大于或小于4%时,有效孔 径均变大,C大于5%时凝胶变脆,不宜使用,实验中最常用的C 是2.6%和3 。

a与b的比例很重要。富有弹性,且完全透明的凝胶,a 与b的重量比应在30左右。常用29 : 1

(7)不连续PAGE的原理:

第一、三个不连续性: ①凝胶孔径的不连续; ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续; ③在电场中形成的电位梯度的不连续。 第二、不连续系统中的三种物理效应: ①电荷效应: ②分子筛效应: ③浓缩效应:

不连续PAGE电泳胶体系统的组成:

电 统 缓冲 pH

8.3 8.8 6.7 8.8 8.3

5% 7% -

1 上层 (负极) 缓冲液 Tris-glycine 2 样本溶液 3 4

胶 体 浓缩胶 分离胶 Tris-glycine Tris-HCl Tris-HCl

5 下层 (正极)缓冲液 Tris-glycine

■ 在浓缩胶中的三个主要作用角色:

荒: pH=8.8 负电 pI=6.7 ¤ 带电

Cl-1:

J 质(酶):

¤pl ¤jl

■ 浓缩效应:

A

样 本 浓 缩 胶

B

C

8.3

6.7

分 离 胶

¤lF

8.8

+

+

三、实验材料、仪器和试剂:

1、实验材料:黄瓜叶片(芽黄叶和正常叶) 2、仪器、器皿:

(1)垂直板电泳装置 (电泳槽,玻璃板,胶条,电泳梳子,制胶架等); (2)稳流稳压电泳仪; (4)电子天平; (6)瓷盘、微量进样器; (3)高速冷冻离心机; (5)电冰箱;

3、试剂:

(1)丙烯酰胺凝胶贮液(Acr-Bis贮液) ; (2)分离胶缓冲液(pH8.8的Tris-HCl缓冲液): (3)浓缩胶缓冲液(pH6.7 Tris-HCl缓冲液): (4)10%SDS

溶液: (5)过硫酸铵溶液,简写Ap(当天配制); (6)TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺); (7)样品提取液: (8)电极缓冲液:(pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液) (9)40%蔗糖: (10)染色液 (11)脱色液

四、实验步骤:

1、贮液的配制: 2、凝胶的制备: 2.1 胶板的制备: 2.2 分离胶的制备: 2.3 浓缩胶的制备: 3、蛋白样品的制备: 4、装槽、点样: 5、电泳: 6、剥胶、染色、脱色:

2.1 胶板的制备:

2.2 分离胶的制备:

按下表制备分离胶(T=10%,pH=8.8)

双蒸水 试剂名 称 取用量 8.03mL 分离胶 缓冲液 5mL 10%SDS 丙胶贮液 Ap TEMED

0.2mL

6.66mL

0.1mL

0.02mL

胶灌至距梳子齿下端1cm →灌毕→封上一层水加速聚 合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。

2.3 浓缩胶的制备: 按下表制备浓缩胶(T=4%,pH=6.7)

双蒸水 试剂名 称 取用量 3mL 浓缩胶 缓冲液 1.25mL 10%SDS 丙胶贮液 Ap TEMED

0.05mL

0.67mL

0.025mL

0.005mL

用滤纸吸干水→倒入浓缩胶→插入梳子→封水, 聚合。

3、植物组织蛋白质提取:

称取大豆叶片1g放在研钵中用液氮研磨,加入3ml样 品提取液,在冰上静置(3小时)。 4℃条件下, 11100rpm离心20min,提取上清夜, 样品制备完成。

4、装槽、点样: 取出胶板下端胶条→用滤纸擦净凡士 油→将胶板固定在电泳槽上(凹板一侧向内) →上下槽装电极缓冲液。

轻拔电泳梳子→用微量进样器点样→每孔约25μl。

5、电泳: 接通电源 → 稳流 → 调节电流到每孔 1mA左右 → 当溴酚蓝前沿进入分离胶后, 适当加大电流 → 待前沿下行到距胶末1cm 停止电泳。

6、剥胶、染色、脱色: 将凝胶板取下→放入装水瓷盘中→剥下胶片→并 浸洗二次→倒去水→加入染色液,过夜。 染色完毕后,倒出染色液,并换脱色液5-6次,直 至凝胶的蓝色背景褪尽,蛋白质区带清晰为止。

五、结果与计算: 绘制蛋白质谱带,计算出迁移率; 六、思考题: 1、影响电泳的主要因素有哪些? 2、简答不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个 不连续,及三种物理效应。

终于下课了!!

范文十:聚丙烯酰胺凝胶双向电泳 投稿:黄骶骷

聚丙烯酰胺凝胶双向电泳

第一部分 实验简介 一、实验目的 通过双向电泳实验,初步掌握电泳的基本理论、双向电 泳实验的设计原理和实验技能。 二、实验原理 根据不同的蛋白质具有不同的分子量和等电点的特 点。利用这一性质首先通过毛细管聚丙烯酰胺凝胶等 电聚焦技术将不同等电点的蛋白质分开,然后通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将相同或相近等电点而分子 量不同的蛋白质进行相对分子量分离。经过二维电泳 分离的蛋白质在二维电泳图谱所处的位置,就是该蛋 白质的相对分子量和等电点。

三、实验流程 蛋白样品的制备 ↓ 等电聚焦凝胶溶液的配制 ↓ 灌注毛细管凝胶 ↓ 组装第一向电泳槽 ↓ 聚焦电泳 ↓ 停止电泳 ↓ 取出毛细管胶 ↓ 毛细管胶置平衡液中平衡

组装第二向电泳槽 ↓ 配制SDS-丙烯胺凝胶溶液 ↓ 灌装SDS-电泳胶 ↓ 第一向凝胶与第二向凝胶拼接 ↓ 接通电源进行SDS-电泳 ↓ 停止电泳取胶 ↓ 凝胶置固定液中固定 ↓ 银染法显色 ↓ 结果分析

第二部分 实验方法 第一向电泳——毛细管等电聚焦电泳(IEF) 1.仪器准备 双向电泳系统一套(见清单) 烧杯1000 mL 、50 mL 各1个 量筒1000 mL (或500 mL)、100 mL 、10 mL各 1个 注 射 器 1 mL( 带 长 针 头 ) 、 微 量 注 射 器 100μ L( 或 50μL)各1支 大塑料盒1个 滴管1支

2.溶液配制 (1)覆盖溶液(25 mL/班) mmol/L DTT 取12 g尿素,0.25 mL两性电解质(pH 3~9.5),12.5 mL的 10%的NP40和0.386 g DTT,用重蒸水溶解后,定容到 25mL。溶液不能受热,储存在冰箱中。 (2)平衡溶液(250 mL/班) Tris-HCl( pH 6.8)缓冲液,含 2%SDS,100 mmol/L DTT和10%甘油 15 mL Tris-HCl(pH 6.8),50 mL 10%SDS,3.86 g DTT和29 mL甘油,用重蒸水定容到250 mL,室温存放。 含8 mol/L尿素,1%两性电解 质pH 3~9.5,5%(w/v) NP40(Nonidet P 40 Substitute)和100

(3) 30%Acrylamide第一向储液(100mL/班) (w/v) acrylamide和1.6%(w/v) N,N'-methylene-bis-acrylamide

含28.4%

用重蒸水先将1.6 g bisacrylamide溶解后,再加入28.4 g acrylamide,溶解,用重蒸水定容到100 mL。如果溶液混 浊,需要进行过滤。溶液存放在棕色瓶中,4°C贮藏, 3~4星期内使用。 (4) 10%(w/v) NP40(20mL/班) 配制100 mL溶液,称量

10 g NP40,用重蒸水定容到100 mL,室温存放。 (5) 20 mmol/L NaOH 配制500 mL,称0.4 g NaOH用蒸馏 水定容到500 mL。

(6) 10 mmol/L H3PO4

配制2000 mL,量取1.35 mL

H3PO4(85%)用蒸馏水定容到2000 mL。 (7)固定液 乙醇35mL,三氯乙酸10 g,磺基水杨酸3.5

g,加蒸馏水定容到100 mL。 (8)脱色液 乙醇25 mL,冰乙酸10 mL,加蒸馏水定容到 100 mL。 (9) 10%过硫酸铵 0.1 g过硫酸铵溶于1mL重蒸水中,在

4ºC冰箱中可保存3~4个星期。

3.实验步骤 (1)准备玻

璃管 取4支18 cm的长玻璃管,洗净晾干。 配制方法见表1。

(2)配制第一向凝胶溶液(8mL /4组) 表1 第一向凝胶溶液配方

尿素 重蒸水 30%Acrylamide储液 搅拌溶解 10%NP40 两性电解质(pH3~9.5) 10%过硫酸铵* TEMED*

3.84 g 2.0 mL 1.6 mL 1.5 mL 0.50 mL 15 µL 10 µL

(3)灌制第一向凝胶(每组2人共制作4根胶柱) 取1支1 mL注射器和一根长针头,吸取约0.5mL第一向凝 胶溶液,再取1支玻璃管,用手指垫一块封口膜堵住玻璃 管的一端,将长针头全部插入玻璃管中,一边注入凝胶溶 液一边后退针头,注意针头不要露出胶面, 直至凝胶溶液 到达玻璃管顶端,撤出针头,用滤纸擦干玻璃管口的凝胶 溶液,然后用封口膜封住该端管口,将玻璃管倒置,将长 针头从玻璃管的另一端插入管内凝胶液面下,用同样方法 加入凝胶溶液至距管口2cm处,将玻璃管垂直放置,然后 立即用微量注射器在胶面上加少量重蒸水覆盖,大约30 min后凝胶聚合。

(4)加样 待凝胶聚合后,用微量注射器吸去覆盖在胶上的 重蒸水。在每根胶柱上加20~30 µL蛋白质样品溶液,然后 再加入覆盖溶液至管口。 (5)安装电泳槽 加样后将玻璃管插入电泳槽的架子上,在

上槽中玻璃管上端露出1 cm,剥去玻璃管下端的封口膜, 准备电泳。在电泳槽的下槽加2000 mL 10 mmol/L H3PO4 溶液,将柱胶下端浸入到H3PO4溶液中,注意胶下端不可 有气泡(如果有气泡,可以先用注射器将胶下端用H3PO4溶 液灌满,再将柱胶插入H3PO4溶液中)。上槽倒入500 mL 20 mmol/L NaOH溶液,盖上电泳槽盖,注意正负电极。

(6)聚胶电泳 在1000~1500 V的电压下进行电泳,直至电流接近于为 零(大约7~8 h)停止电泳。如果聚焦好的凝胶不能马上进行 第二向电泳,在管内放置了几小时以上, 可在走第二向电 泳之前再聚焦电泳1~2h,以消除样品受扩散的影响。 (7)退胶 电泳结束后,在整极端凝胶内插入约1cm长的铜丝作为 标记,用洗耳球从玻璃管上样端轻轻挤入空气,将凝胶退 胶或用10mL注射器和长针头吸入一定的蒸馏水,将长针 头一边沿管壁推入一边注入蒸馏水使凝胶退出。

(8)平衡: 将推出的一条凝胶条放入盛有10ml平衡液的小烧杯中, 浸泡平衡20 min,然后进行第二向电泳. (9)染色: 另一条胶放入固定液中固定1~2 h,用考马斯亮蓝R250 染色1 h,再用脱色液脱色,观察第一向聚焦效果。

第二向电泳--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电(SDS-PAGE) 1.溶液配制 (1) 30%Acrylamide第二向储液(500 mL/班) (w/v) acrylamide和0.9%(w/v) N,N'-methylene-bis-acrylamide,配制方法同第一向储液。 (2) 10%SDS 称10 g SDS用重蒸水溶解,定容到100 含29.1%

mL,室温存放。

(3)分离胶缓冲液(300 mL/班) 液,pH8.9。

1.5 mol /L Tris-HCl缓

称Tris 109 g,取1 mol/L HCl 144 mL,用重蒸水定容至300 mL,4°C保存。 (4)浓缩胶缓冲液(300 mL/班) 液,pH8.9。 称Tris 6 g,取1 mol/L HCl 48 mL,用重蒸水定容至100 mL,4°C保存。 (5)电极缓冲液(2500 mL/2组) 称6 g的Tris,29 g甘氨 酸,2.5 g SDS,用蒸馏水定容到2.5 L。 0.5 mol /L Tris-HCl缓冲

(5)电极缓冲液(2500 mL/2组) 称6 g的Tris,29 g甘氨 酸,2.5 g SDS,用蒸馏水定容到2.5 L。 (6)固定液 100 mL。 (7)染色液 0.25 g考马斯亮蓝R-250,40 mL乙醇,10 mL 乙醇50 mL,冰醋酸10 mL,用蒸馏水定容至

冰醋酸,用水定容到100 mL。 (8) 10%过硫酸铵、脱色液 同第一向电泳。

2.实验步骤 (1)组装夹心式玻璃板、制胶支架底座调水平; 取一块长玻璃板和一块带磨口槽的短玻璃板,将短玻璃 板带磨口槽的一边位于上端与长玻璃相对,两玻璃板之间 的左、右两端各放入一条间隔条,对齐,插入玻璃板固定 夹,将上面的固定螺丝拧紧,将此夹心式玻璃板放入制胶 支架底座,插入凸轮,向内侧推入并旋转180º,夹心式玻 璃板即被固定。

(2)分离胶配制 分离胶按照凝胶浓度不同分为三层,自下 而上浓度递减,每层高度约4~5 cm,分别按照表2配制, 并依次灌制。

凝胶浓度 试剂 18% 30%Acrylamide储液 /mL 分离胶缓冲液 /mL 重蒸水 /mL 10%SDS /mL TEMED /µL 10%AP /µL 总体积 /mL 7.2 3.0 1.6 0.12 20 30 12 12% 4.8 3.0 4.0 0.12 20 30 12 7% 2.8 3.0 6.0 0.12 20 30 12

(3)灌注分离胶 首先将配制的第一层凝胶溶液用滴管沿着长玻璃板内 侧缓缓加入凝胶腔,小心不产生气泡,然后用少量1/4浓 度的分离胶缓冲液封胶面(高度约2 mm),凝胶聚合大 约30min。 待凝胶聚合后用滤纸片吸干封胶缓冲液 ,灌注第二层 凝胶溶液,并封胶面。 凝胶聚合后灌注第三层凝胶溶液,最终凝胶距离短玻璃 板上沿3 cm左右, 最后用1/4浓度的分离胶缓冲液封胶面 (约20 mm)。

(4)配制和灌注浓缩胶 用滤纸吸去分离胶上面封的分离胶缓冲液,然后加入浓 缩胶溶液,插入样品槽模板,凝胶溶液应到达短玻璃板上 沿,聚合0.5~1 h。浓缩胶溶液配制方法见表3。

凝胶浓度 试剂 5% 30%Acrylamide储液 /mL 浓缩胶缓冲液 /mL 重蒸水 /mL 10%SDS /mL TEMED /µL 10%AP /µL 总体积 /mL 2.5 2.0 10.2 0.15 30 45 15

(5)安装第二向电泳装置 在冷却槽上取下红色密封条,安装上白色密封条,将夹心 式凝胶板从灌胶支架底座上取下,安装在冷却槽上。

(6)凝胶拼接 ① 将平衡好的胶条用少量的电极缓冲液漂洗,摆放在一 块干净的玻璃板上,胶条的正极端位于小加样槽一端。胶 条两端各切去约2 cm,使凝胶长度略短于加样槽; ② 轻轻拔出样品槽模板,在小加样槽中加入5~10 µL标准 蛋白质; ③ 用滴管将已加热融

化的用电极缓冲液配制的1%琼脂快 速加在浓缩胶上,使琼脂在浓缩胶上铺开形成一层水平的 胶层,琼脂高度为1~2 mm;

④ 待琼脂凝固,将放着胶条的玻璃板靠近短板,使胶条 滑入槽内,平铺在琼脂上,将胶条与琼脂胶紧密结合; ⑤ 用滴管加融化的琼脂于胶条上,使到达短板上沿,将 胶条包埋; ⑥ 滴加融化的琼脂到玻璃板与冷却槽交接处,密封上 槽。

(7)电泳 将电泳装置放入电泳槽中,在上槽中灌入电极缓冲 液,缓冲液高过短板,其余缓冲液到入下槽,应高过凝胶 板下沿2 cm。盖上电泳槽盖子,接通电源,恒压60V,电 泳30 min,样品进入凝胶后,调节恒压250V,电泳至溴酚 兰到达分离胶底部1cm左右时停止。 (8)固定 倒去电极缓冲液,拆开电泳槽,取下凝胶板,放入固定 液中,室温过夜。

(9)染色和脱色 用考马斯亮蓝R250染色液染色2 h,用脱色液脱色,直 至背景清晰。 (10)实验结果 凝胶扫描。

蛋白质银染色技术 1、准备试剂 甲醇、 甲醛 DTT AgNO3 Na2CO3 1000ml 100ml 500mg 5000mg 60g 冰醋酸、 500ml

2、试剂配制(每个组) (1) 40%甲醇-10%冰醋酸 150ml。 (2) 10%甲醇-5%冰醋酸 150ml。 (3) 5μg/ml的DTT溶液 150ml。 (4) 0.25%AgNO3溶液 150ml。 (5) 3%Na2CO3溶液 150ml。 (6) 3%Na2CO3溶液(内含60-100μl/100ml甲醛) 150ml。 (7) 5%的冰醋酸溶液 150ml。

3\操作步骤 ① 将胶置于150ml 40%甲醇-10%冰醋酸中浸泡,摇动 固定过夜。 ② 取出胶,置于120ml 10%甲醇-5%冰醋酸中浸泡,摇 动固定30min。 ③ 用去离子水将胶浸泡、漂洗,第一、二次,每次间隔 20min。 ④ 去离子水摇动漂洗,第三、四次,每次间隔30min换水 一次。 ⑤ 倾出去离子水,加入5μg/ml的DTT溶液120ml,摇动 浸泡30min。

⑥ 用去离子漂洗一次,然后将胶放在120ml 0.25% AgNO3中浸泡30min。 ⑦ 用大量的去离子水将胶漂洗约2-3min。 ⑧ 将凝胶放入120mL 3%Na2CO3溶液中浸泡3-5min。 ⑨ 将凝胶放在3%Na2CO3溶液(内含120μl/120ml甲 醛,可根据情况增减)的显影液中显影。 ⑩ 等蛋白斑点清楚后,将胶放在5%的冰醋酸溶液中 10min停止反应。用蒸馏水将胶漂洗干净。

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