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芳香族氨基酸

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范文一:芳香族氨基酸在732树脂上的三组分吸附平衡 投稿:郭嘀嘁

21 0 2年 3月  

食品研究与开发 

F o  e ac  n  ee p et od s rh dD vl m n R e A o   基础 研 究 

3  4

第3 3卷第 3期 

芳香族氨基酸在 7 2 3 树脂上的三组分吸附平衡 

陈小敏  王中来 -, , ,周伟 章  陈宇  。 (. 1 福州大学 生物科学与工程学 院 , 福建 福 州 3 0 0 ; . 5 18 2福州大学 至诚 学院 , 福建 福州 3 0 0 ) 5 0 2 

摘 要 : 究芳 香族 氨 基 酸 ( 一 研 L 色氨 酸 、一 丙氨 酸 和 L 酪 氨 酸 ) 氢型 7 2树 脂 上 的 三 组 分 吸 附平 衡 过 程 。 考 察  L苯 一 在 3

了初 始 p 和 温 度 对 吸 附 等 温 线 的 影 响 ,并 用扩 展 的 Fenl h模 型 对 三 组 分 吸 附 平衡 过 程 进 行 了 拟合 。 结 果 表  H r di u c 明 ,— v、 — r L TrL Tp和 L P e的平 衡 吸 附量 随 p 的 减 小 和 温度 的 升 高 而 降 低 ;   H 1 ( —h H 3 - " p = . 即料 液 中存 在 过 多 H ) ,   0  时 则 会 显 著 降低 氨 基 酸在 树 脂 上 的 平 衡 吸 附 量 ;三组 分吸 附行 为表 明 ,— r 该 三 组 分 吸 附 系统 中的 强 吸 附 质 ,— h  L Tp是 L Pe

次之 , L T r 而 — y 最弱 ; 扩展的 Fen lh模 型能够较 好地描 述 3种氨基酸在氢型 7 2树脂上的三组分吸附平衡过程 , r di u c 3  

所 得 的 三 组 分 吸 附 平衡 方程 在 = . 1水平 上 高度 显 著 , 平 均相 对 误 差 在 0 4%~ . 00 0 其 . 3 2 0%之 间 。 8  

关 键 词 :一 I 色氨 酸 ;一 丙氨 酸 ;一 氨 酸 ; 组 分 吸 附平衡 ;   L苯 L酪 三 氢型 7 2 脂  3树

A  t y o   d o pto   u lb i  o   S ud   f s r i n Eq ii rum f rThr eAr m a i  A e  o tcAm i   i   n H  f r   3   t0 noAcdso   - o m 7 2Ca in—e c ng   sn   x ha e Re i s CHEN Xio mi  , ANG  h n —li’ Z OU  e — h n   ,   a— n W Z o g a  , H W i z a g CHEN Yu    

( . olg f ilgcl ce c n  e h ooy F zo   iesy F z o  5 1 8 F j n, hn ; 1 C l eo  oo ia  in ea dT c n lg, uh uUnv ri , u h u3 0 0 , ui C ia  e B S t a

2 C lg    ih n, uhuU i r t F zo 50 2F j nC ia  . o

ee f hC eg F zo nv sy uhu30 0 , i ,hn ) l oZ e i, ua

Ab t a t:T e p o e so  d o p in e u l ru wa n e tg td frt e s l t n   ft re a n   cd , i h sr c h   r c s  fa s r t   q ii im  si v si ae  o h   ou i so h e   mi oa i s wh c   o b o c n it fL—r p o a , tr snea d L p e yaa ie a s r e  n H  f r 7 2c to —e c a g  e i si   o ss    ty tph n L- yo i   n   — h n l lnn , d o b do   一 m  3   ain x h n er sn  na o o c n t n —tmp r tr b t . T e fe t o b t   h  i i a p o sa t e e au e ah h  ef cs f oh t e nt l H v l e n  t e e e au e n d o t n i au  a d h  t mp r t r o  a s r i   p o e u l rum  r  t d e Th   d o t n e u l ru io h r   r  e r s n e   t  h   r u d ih e u to   q ii i we esu id. e a s r i   q iii m s t e mswe er p e e td wi t e F e n lc   q ain. b p o b h I i h we   t h   q i b i m mo n fa s r t nfrL- r L Tr  n   Ph  e u e   t h   e r a eo   t ss o d t   ee ul ru a u t  d o i     Ty , — p a d L- er d c d wi t ed c e s  f   ha t i o p o o h t ei i a  H  au   n   t h  n r a eo   mp r t r . d te a o n  fa s r t n d c e s d sg i c nl  h  nt lp v l e a d wi t e ic e s  ft i h e e au e An  h   m u to  d o i   e r a e   inf a t p o i y d et h  x e so   u  ot ee c s  fH whe  h  n t l n te iii   a pH  s10 Th  to g s  d o b t sL- p t es c n  sL- h , n   wa   .. e sr n e t s r a ei  Tr , h  e o d i  P e a d a t ewe k s sL— ri h  d o p ins se . ea s r

t ne u lb u ioh r   rL- y , - p a d L— h   h   a e t   Ty nt ea s r t  y tm Th   d o i  q iir m s t e msf   T r L Tr  n   P e i o p o i o o   t f r 7 2 c to e c a g   e is c u d b   r d ce   l b   h   xe de   r u d ih e u to .T e n t 一 m  3   ain— x h n e r sn   o l  e p e it d wel y t e e t n d F e n lc   q ai n h   o  

e uain   r   i hy sg i c n  t = 0  e e . h   a  e aie er r  r d ce   y F e n lc   q ain   q t swe eh g l  inf a ta  0.01 lv 1 T e me n r lt   ro sp e it db   r u d ih e u to s o i v we eb t e   .4 % a d2.0% . r   ewe n 03 n  8  

Ke   y wor s:L- r p o h n; p e y aa i e; tr sn a s r t n e u l rum  ftr e c mp n n s H  f r d ty tp a L— h n l1n n L- y o ie; d o p i  q ii i o b o h e   o o e t ; 一 m  o 7 2c t n— x h n er sn 3  ai e c a g  e i  o

L 色氨酸 ( - r ) 一 L T 的生产方法 主要有生 物资源 提  p

用并且 处于主导地 位『 一 1 l 色氨酸发 酵液 中还 可能 含  。L 有 多种氨基酸 , 包括 L 苯丙氨 酸( — h ) L 酪氨酸  一 L Pe和 一

取法 、 化学合成法 、 发酵法和酶法 。但是 随着对微生 物 

法生产 色 氨酸研究 的不断深人 , 微生 物法 已经 走 向实 

基金项 目: 福建省 自然科学基金 (0 00 2 6) 2 1J 1 8   作者 简介 : 陈小敏 (9 5 ) 女( )在 读硕士研究生 , 】8 一 , 汉 , 研究方 向 : 生 

物 分 离 与 产  I 。 诮 .   程

( — y) 。从 发酵液 中分离纯化氨基 酸是氨基酸 T业  L T r[ 2 1

生产 中的一个重要 环节 , 在其投资费用 中占很大 比例。   分 离纯 化方法 主要 有离 子交 换法 I 结 晶法 [ , 中  3 1 、 4 其 1 等

离子交换法具有 工艺简便 、 投资少 、 节能 和污染 小等优  点 ,适合 于工业推 广 。分 离 中性 氨基酸较常采 用聚苯 

通信作者 : 千中来(9 9 )男 , 15 一 , 教授 。  

◆ ● ● I● ● ● I◆ 4b I● - ● ●   I

I● ◆ I● I◆ I ◆ I I● I ◆ ◆   I h● ◆  ● I● l l I I◆

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4t   ● -i h

I ●

●  

【I 沈萍, 秀容 , 1   I 范 李广武. 微生物学 实验[ . 北京 : M] 3版. 高等教育 出版 

丰 .9 92 4 十 1 9 :1  

[. J动物医学进展,0 52 6: - 8 1 2 0 ,6() 5 9  9

l] 2 王德海, 国富. 程 1 0种中草药对金黄色 葡萄球 菌的体外抗菌试 验 

收稿 日期 :0 10 — 9 2 1— 7 1 

基础研 究 

陈小敏 , 芳香族氨基酸在 72 等: 3 树脂上的三组分吸附平衡 

3 5 ==   I

乙烯型强 酸 陛阳离子交换色谱法期 L 色氨酸 、一 。一 L 苯丙  氨酸 和 L 酪 氨酸 3 芳香族 氨基酸 均属偏 中性 氨基  一 种

2 22 0 m条件下测定混合组分 的吸光度值 , 2 、3 n 由标准 曲 

线计算出平衡 农度 , 进而由下式计算平衡吸附量 :  

q ( - /   ,C C m =o () 2 

酸, 结构相似 , 分离较 难 。因此用离子交换树脂分别提 

纯各种 中性氨基 酸时 , 三者 的竞争 作用会 影响 到单个 

式 中:  q 为平衡 吸附量 ,m o g  为平衡 浓度 , ( m l) /   ( m l )c 为溶质 的初始浓度 ,m o L ; m o L .n / (m l) /  为溶液体 

积 ,; Lm为树脂质量 ,。 g  1 _ 温度对 吸附等 温线 的影响  .4 2 配制 三组分 母液 ( 浓度 L P e 4m o/ , — y : — h :  m l L T r L  

2m o L L Tp 6 o L 5 0m 。取 10   m l ,— r :  | )0   L / mm / 0  mL容量瓶 

氨基 酸提纯 回收的效果闸  。

本研 究探讨 了 3 种芳香族 氨基酸 ( 一 L 色氨酸 、一 L  苯丙氨 酸和 L 酪氨 酸 ) - 在氢型 7 2 3 树脂上 的三组分吸  附平衡 过程 ,重点考察 了料 液初始 p H和温度 两个 因  素对 吸附等温线 的影 响 ,并 应用扩展 的 Fe nl h模  r di u c 型拟合三组 分吸附平衡 数据 , 为多组分 氨基酸 的工业 

7只 , 号 , 编 分别 移取 1 、54 、0 6 、0 8   L母液  0 2 、0 5 、0 7 、0m

于各容量瓶 , 定容。加至 已准确称取 0  树脂 的 2 0   .g 5 5 mL 锥形瓶 中。 分别在 2 、0 3 ℃条件下恒温振荡 5h 反  5 3 、5  。 应结束 后 , 分别在 波长 2 4 2 6 2 8 2 82 2 2 0l   0 、0 、0 、1 、2 、3  m l

吸附过程 的设计

提供 基础数据 。  

1 材 料 与 方 法 

1 材料 和仪器设 备  . 1 72 3 离子交换树脂 :上海化学试 剂有限公司 ;一 L 色  氨酸: 日本进 口分 装 ; 一 L 苯丙 氨酸 ( 析纯 )L 酪氨酸  分 、一

下测定混合组: 分的吸光度值 , 计算 出平衡浓度 , 进而计 

算 出平衡吸附量 , 出吸附等温线 。 作   1 . 多组分 吸附平衡模 型  .5 2 多组分吸附平衡模 型可用 多种方式来描述 【。本  l 1 1 研究采用扩展 的 Fen l h 型预测平衡数据 。扩展  ru di 模 c

的 Fen l h吸附等温式[为 : r de u i     2 1

( 分析纯 )国药集 团上海化学试剂公 司; : 盐酸( 纯 ) 分析 :  

上海联 试化工试剂有 限公司 ;P 72紫外 可见分 光光  S一5 度计 :上海 光谱仪 器有 限公 司; H — 恒温振荡器 : C AS 常  州 国华电器有 限公 司。  

1 方法  . 2 1 . 树脂预处理用 .1 2  

【   f 卜  

』= ,   J  

(   3)

式 中 : 为树脂对 组分 i q   的吸 附量 ,m o g  、  ( ml ) q /

分别为液相主体 的溶质  √的平衡浓度 ,m o L ; ( ml ) /  为 

先用蒸馏水冲洗 7 2 3 树脂除去杂质 , 再用 2 l   / moL的 

HC 和 N O 1 a H溶液反 复浸 泡 3次 ,用去离子水洗 至 中 

吸 附剂对组 分 吸附容 量有关 的参数  为 与吸 附分 

子i 和吸 附剂 表面作 用强度有 关 的参 数 ; n 和 嘞均   、  可 由实验数据拟合得到 , 本实验范围内 n 3 1   ≤n  = ,≤ √ 。

2 结 果 与 讨 论 

性, 最后 用 2m l   o L的 H 1 / C 溶液将树脂 转成 H 型 ,   用去 

离子水洗至 中性 , 6 在 0℃烘 箱 内烘 干 6h 置于干燥   后

器 中备用 。   1 . 分析方法  .2 2

三 组分 吸 附系统 中 ,采用 三波 长法 作为 测定 方  法 。分别在 2 4 2 6 2 8 2 82 2 2 0 m条件下测定  0 、0 、0 、1 、2 、3r i 混合组分 的吸光值 , 利用如下公式 o l :  

L 色氨酸 : 一 △  2- .1  2— . 99    1 0 4 0 0 9   1o 8 3 4 7 /3 2 L 酷氨酸 : =   + . 3 2— . 99   ( ) 一 △A A3 0 3  0 0 0   2 2 0 0 4 2 A  8 1 

21 标准 曲线 的测定  . 用p 5 H= . 0的盐酸溶液配制三组分 ( — r,— y, L Tp L T r   L P e 摩尔浓度 相等的母 液 (   o L , —h ) 2 mm l )并用 p = . / H 5  0 盐酸溶液逐级稀 释至适

当浓度 ,H= . p 5 0盐酸溶液 做为 

空白, 分别 在不 同 的波长 ( — r :1 、0 、3 m; — L T1 2 8 2 4 20n L   )

L 苯丙氨酸 :   2+ . 27  — .6    一 △A 0 0 7   2 09 8 A 6 2 A0 8 2

r r2 0 2 8 24 l L P e2 6 2 8 2 2n ) 测定  r :3 、 1 、0  m;— h :0 、0 、2 m 下 v q 吸光度值 , 由公式 ( ) 1计算 出△A。以浓度为横坐标 , 吸  光度值为纵坐标做 出 L Tp L T r L P e — r 、— y 和 — h 的标准 曲 

线, 如图 1 所示  所得标准曲线方程为 :  

L Tp: — r AA= 35 .   .0 2 .c R :1   0 L P e AA= .9 , 209 6 —h : 53 e R = .9   (   4) () 5 

计算 出各组分 的△A,由标准 曲线 算 出各组 分 的 

浓度 。  

1 . 初始 p .3 2 H对吸附等温线 的影 响  三组 分母液 的配制 :用去 离子水 和盐 酸配制 p   H 分别 为 1 、.、.、.、. . 20 3 4 5 0 0 0 0的母液 各 5 0m ( 0   L 浓度 L   —

P e6m l , — y:  oL L— W:0m o L , h :  moL L T r mm ] , T 1  m l ) 备  / 4 / /

L T r LA 2 0 ,  0 9   — y:k = . c R= . 7 8 9

() 6 

用 。取 10 L容量 瓶 7只 , 0m 编号 , 分别移取 3 、05 、 04 、0 

6 、0 8 、0 L母液于各容 量瓶 , 07 、0 9 m 定容 , 加入到 已准确  称取 0   树脂 的 2 0 .g 5 5 mL的锥 形瓶中。在摇 床中 3 ℃  O 恒温振荡 5 。反应结束后 ,分别在 24 2 62 8 2 8    h 0. 0 、0 、1 、 、

2 初始 p . 2 H对吸附等温线 的影响 

溶液 的 D H会影 响树脂交换基 团及交 换离子 的解  离程度 , 以致影响氨基酸和吸 附剂之 间的静 电作用 , 从 

而影响树脂的交换容量和吸附 的选择性【。 l  3 1

.= =

3  6

陈小 等: 敏, 芳香族 氨基酸在72 3树脂上的三组分吸附平 衡 

基础研究 

温线 ( 初始浓度 I P e0   m l ,- y:.m ] ,— 厂 h :.m oL LT r 4 moLL   6 / 0  ] Tp1 mm l ) r :. oL 。由图 2 图 4可知 , 0 / ~ 一般 晴况下 ,  v、 L r   L1 和 LP e _  - h 的平衡 吸附量 随 p H的减小而 降低 ( 说  明 : 3中 p =.时例外 , 图 H3 0 有待今后进一步深究 ) 。   由图 4可见 ,H处于 3 ~

. 围时 ,— r p .5 0 0范 L Tp平衡 

吸附量变 化较小 ,其原 因可能与 L Tp为偏 中性氨基  —r

酸 ( 电点 为 58 ) 等 . 有关 , 中性氨 基酸 在强酸性 阳离  9 因 子 交换树 脂 上 的分离 主要 是 由其侧 基 与树 脂骨 架 之  间 的疏水作用所控制f 5 j 。此外 , 也可能 与 L Tp的初 始  —r

浓度/ ( l) mmo L  / 图 1 H50条 件 下 三 组 分 标 准 曲线   p .

Fi . S an r   ur e   fTh e -c m p ne swh n p = 0 g 1 t da d c v so   r e o o nt  e   H S. 

浓 度较高 、 实验误差较小有关 。  

当p 1 H= . , 0时 3种氨基酸 的平衡 吸附量均显著 减  少 。其原 因可能为 : p 在 H较低 时 , 附到树 脂上 的氨  吸 基酸 又被溶液 中过多 的 H 置换下 来 ,即大量 的氢 离  + 子和 氨基酸 阳离 子产生竞 争吸附作用 , 氨基酸在 树  使

皇   宣 

脂上 的平衡 吸附量显著 减少㈣。  

23 温度对 吸附等 温线的影响  _

莲 

考察 了 p : . H5 0条件下 , 温度对三组 分 ( — h 、— L P eL  

T r L Tp v 和 — r )溶 液 ( 始 浓 度 L P e 0 m o L L   初 — h :. m l , — 4 /

T r02 m l , — r :. moL y :. o L L Tp 0 m l )在 氢 型 7 2树 脂上  m / 6 / 3

平衡浓度/mm l ) ( o/   L

图 2 H 对 L P e吸 附等 温 线 的 影 响 ( 3      p —h T= 0o C)

Fi .  Efe t fp o  hee ulb im  pt eo   g2 f cso  H nt  q iiru u ak  fL-Ph T=3 e( 0℃ )  

吸附平衡 的影响。其结果如 图 5 图 7所示 。 ~  

星   暑  

皿  唧

量   暑 

蓝 

1  

蓝 

平衡浓度/mmoL) ( l   / 平衡浓度Imm [   ( o/ L) 图 3 p 对 L— y  H T r吸 附等 温 线 的 影 响 ( = 0℃ ) T3  

F g3 E e t o p o   ee ul ru u tk   L Ty ( = 0℃) i . f c  f H nt   i b i m p a e   s h q i f O — rT 3  

图 5 温度对 L— h p e吸附等温线 的影 响( H= .) p 50 

Fi .   Efe t   ft m p r t e o   e a s r to  s t r o   g5 f c o  e e a ur   n t   d o p i n io he m  fL—P   s h he

(H= .) p 50 

宕 

星  

三 

}  

量  

皿I

Ⅲ   j

蓝 

莲 

平衡浓 度/m l ) ( mo L   / 图 4p   H对 L T p吸附等温线的影响( - 0℃ ) —r T  ̄  

F g4 E e t o p o   e q ib u u t k  f T p( = 0℃1 i.  f c  f H n t   u l r m  p eo L- r T 3 s h e ii a  

平衡浓度/ mo/) ( l   m L 图 6 温度对 L— y T r吸附等温线的影响( H= .   p 50)

Fi .   Efe t   t mpe a u e o   e a s r to   o he   f g6 f c o e sf r tr  nt   d o p ini t r o   h s m

图 2 图 4是 p ~ H处 于 1 ~ . 围时 ,- h 、 — .5 0 0范 L P eL   r r L Tp三组分溶 液在氢 型 7 2树 脂上 的吸 附等  r 和 -r y 3

L T r p S0 — y ( n= . 

基 础研 究 

陈小敏 , 芳香族氨基酸在 72 等: 3 树脂上的三组分吸附平衡 

3 = =  7 I

为强 吸附质 , 郑红 【 L Tp和 L P e 2 t —r 1 从 — h 双组 分吸 附平 

衡 实验 中得 出 L Tp — r 为强 吸附质 。 因此 , 她们的研究结 

论完全符合本研究所得出 的规律 。  

等  

2 多组分吸附平衡模型  . 4

根据扩展 Fen l h模 型 , 用 m t b软件分 别  r di u c 采 al a

对不 同初始 p H条件下 L T rL Tp和 L P e — v、— r — h 三组 分  吸附平衡数 据进行拟 合( 图 2 图 4 , 出三组分 溶  见 ~ )得 液在 7 2 脂上 的吸附等温线方程 。例如 ,= 0o和  3树 T 3  C

p 5 H= . 0条件下 的吸附等温线方程为 :  

平衡浓度/ ( l) mmo L  /

图 7温 度 对 L T p吸 附 等 温 线 的 影 响 ( H= .) -r p 50 

Fi .  Efe t  ft m p r t r   n t   d o p i n i o he m  f g7 f c so   e e a u eo  hea s r to  s t r o  

q= . c c 1 9 20 7 c)   l1 8 1 】 . c . 33。 5  + 8 + 4 n q= . 420 3 c c 02 13 205 c . 6 1 2 . c) 8 (5 ++ 6   q= 4932 7 l .52c) 31 . ( . c 48c 3 c 4 + +   () 7 

L- r p 50  T p( H= .)

式中: 下标 1 和 3 、 2 分别表示 L- eL Tr LTp  -h 、’y 和 - r。 P

表 1 出 了在 T 3  时 不 同初始 p 给 ‘ = 0o C H条 件下 拟 

由图 5 图 7可 知 ,随着温度 的升高 , ~ 3

种氨基 酸 

在氢型 7 2树脂上 的平衡 吸附量 略有 下降。这是 由于  3

当温度 升高后 , 氨基酸侧链 与树脂疏 水部位 发生 的疏 

合 的 L P eL T r L Tp三组分在氢 型 7 2 — h 、— y 和 — r 3 树脂上  吸附 的实验数 据 ( 图 2 图 4 得 到的方程 ( ) 见 ~ ) 3 中的常 

水 吸附作用被破坏 , 亲合力变弱 , 氨基 酸容易从结合位  点上脱落 , 导致吸 附量下 降 。此外 , 明在所选 的浓  说 度 范 围内 , 种 氨基 酸在 氢型 7 2树脂上 的离 子交 换  3 3

吸附是一种放热过程 ( H< )温度 升高不 利于吸附【。 A 0,    6 1 李长 海等 研 究 了弱碱 性树 脂 吸附 B 萘磺 酸 、 2O 一 HS   和H S , 2O 的单 组分 吸附平衡 , 出随着温度 的升高 , 指 各 

数 以及相关 系数 r 和平均相对误差 。  

3 结 论 

1 研究 了三组 分芳香 族氨 基 酸 ( — h 、 — y 和  ) L P eL T r L Tp 在氢 型 7 2 脂上 的吸附平衡 过程 , - r) 3树 考察 了料 

液初 始 p H和温度变化对 吸附等温线 的影 响 。一般情 

况下 ,— y 、— r L P e的平衡吸附量 随 p L T rL Tp和 — h H的减  小 而降低 ,尤其 当料液初 始 p 1 H= . , 0时 3种氨基酸 的  平衡 吸附量均显著 降低 。   2 当温度 处 于 2 ) 5℃~ 5℃时 , 3 随着 温 度 的升 高 ,  

组分 的平衡 吸附容量逐 渐降低 , 明低 温有利于吸附 , 表   吸附过程为放热过程 。也有大量实验证 明[ 1 随着温  19 8】 -, -

度 的升高 , 氨基酸 的吸附量会 降低 。   三组分 吸附能力大小 的比较见 图 8  。

平衡 吸附量 略有 下降。三组分 吸附行 为表明 ,— r 是  L Tp 该 三组分 吸附 系统 中的强吸 附质 , 3个组 分 的吸附能 

力大小顺序是 :. r> — h> — y。 L一 p L P e L T r T  

3在 T 3 : p = . 50 , 扩展 Fe nl h ) = 0c和 H 1 ~ .下 用 【 0 ru d c  i

里  

面  

莲 

方 程 拟合 L P eL T r L Tp三组 分 物 系在氢 型  —h 、—y 和 —r 7 2树脂 上 的吸附平 衡数 据 ,所得 回归 方程 均在 0   3 【 = 00 1 . 水平 上高度显 著 , 0 且其平均 相对误差 在 03 . 4%~   28 %之间 。因此 ,ru di 方 程适用于描述该三组  . 0 Fen l h c

分芳香族氨基 酸在 氢型 7 2 3 树脂上 的吸附平衡过程 。  

参 考文献 :  

… 胡 耀辉 , 王玉华 , 于寒松 , L 色氨 酸的应 用及生产技 术研究

  等. 一

进展[]吉林农业大学学报 , 0 ,04 :8— 8  J. 2 83 ()5 6 5 9 0 [] 梅 丛笑 . 一 2 L 色氨 酸提 取 工艺研 究[ . D1 天津 : 天津轻 工 业学 院,  

2 0 :4 2   0 02 — 5

半 衡 浓 度 /mm l   ( o/ L)

图 8T 3   = 0℃下三组分吸附等温线( t= .) pl 50 

Fi .   Ad o p i n I o he m   fTh e - o g8 s r to  s t r o   r e e mpo e t   n  ̄ s whe   n T=3   0o C 

( H= .1 p 50 

在 T 3 c、H 5 以及初始浓度 L P e0 mm l 、 =0《 p -. = 0 - h=. oL  4 / L T r0   m l — y= . m o L和 L Tp 06m o L的条 件 下 , 2 / — r= . m V   由  图8 可见 , 在平衡 浓度一定时 , 该吸附系统 中三组分 的 

[】 OHA AM, O HIAWAY K WA HI   ea. E F R N 3 K  YS K  , A S MAN,t 1V R AH E     Z RIO I R NGV NL AMI S E R N[]E rp a ,R2  U   LE U  O — S NO A U E P. uoen F —

5 7 7 , 9 5 0 -1   5 8 2 1 8 — 7 -2

吸附能力大/ ) 序是 :— r> — h> — y。刘 静霞【 bl  ̄ L Tp L P e L T r 倒  

从 L Tr L P e — y 和 — h 双组分 吸附平衡实验 中得 出 L P e — h 

[】 B R A DB G YG, E AN R   ,t1 rcsfreoeig 4 E N R  , U   AL X D ELCe . oeso  cvr   aP   r n

ty tp a   r o e o  t  e i a ie   n   t  s  n a p o e s f rt e r p o h n o   n   fi d rv tv sa d i u e i     r c s    h   s s o

- :  =

8  

陈小 等: 敏, 芳香族氨基酸在72 3 树脂上的三组分吸附平 衡 

表 1 三组分溶液在不 同 p 条件时 F en l h方程的拟合参数f - O℃ ) H ru di c   3 T  

Ta l  F t n   a a tr  f r u d i   u t n u d rDi ee tp v l e( 3 be 1 i i gP r me eso   e n l h Eq a o   n e   f r n   H  au T= 0℃) t F c i  

基础研究 

注: 当显著性水平取 o= . 1和试 验次数 N 7时 , 【O0 0 = 临界相关系数 为 09 1 .5 。表 1 显示所 有相关系数 r 均大于 O9

1 故拟合结果在 d= .0  .5 , O0 1

水平上高度显著。此外 , 行模 型拟合过程 中发 现 , 合精度 与氨基酸的初 始浓度有关 , 酸初始 浓度过 低时 , 在进 拟 氨基 拟合误差较大 。  

ezmaisnhss frpoh nP. uo en F 2 8 6 4 18 一 ny t   teio t t a[]E rpa , R 5 15 , 9 6   cy   y p

l -1   1 4

S i2 0 , 0 1 ) 5 2 - 0 4 c,0 5 6 (8 :0 2 5 3  

【4 AK C S C L K G, Y A   e a. eaa o  ieiso  — 1 】T A   , A I  A T R M,t 1 Sprt nknt  fL     i c p e ya nn yin eca g rcs[.ice ia n ier g h nll ieb  - xh nepo esJBoh m cl gne n  a o ] e i junl19 ,()1 1 12 ora,9 8 22:0 — 1  [5 1 ]武彩莲. 发酵液中 L 色氨酸分离纯化工艺研究II _ J 氨基酸 和生物  . 资 源,0 72 ()4 — 6 2 0 ,93 :2 4  

[】 刘菊湘 , 国栋 , 5 刘 阎虎生 , . 等 用低交换容量聚苯 乙烯 型强酸性阳  离 于交换树脂 柱色谱 分离 中性氨基 酸… . 高等 学校化 学学报 ,  

2 0 ,21)2 0 - 1 3 0 12 (2 :10 2 0 

[】 刘静霞, 中来, 6 王 张苗, L 酪氨酸和 L 苯丙 氨酸在 72树脂上  等。 一 一 3

的吸附平衡f . J 福建 轻纺 , 0 ( )8 — 4 1 2 61 :3 9   0 1

【] 郑红,王 中来. 色氨酸和 L 苯丙氨酸在 7 2树脂上 的吸附平  7 I 一 一 3 衡『1 J. 福州 大学学报 : 自然科 学版, 1 , ()12 16 2 03 1:4 — 4   0 8 [J 曹伟 , 8 付佩玉 , 国良_ 孙 三波长分光光度法测定色氨 酸 、 酪氨酸和  苯丙氨酸的研究『1 J_ 光谱学与光谱 分析 ,9 2 1 ()l9 12 19 ,52: 1— 2  

[6 高强 , 耀 , 1】 徐 吴东 , 氨 基酸在 固体 表面 的吸附  . 学进 展 , 等. 化  

2 0 , 96 : 0 6 1 2   0 7 1 () 1 1 — 0 4

【7 l]李长海 , 石宏仁 , 佟克 , 弱碱性树脂分 离 p 萘磺 酸废水 吸附  等. ~ 平衡研 究『. J 吉林化工学院学报 ,04, 1 )4 8 ] 2 0 2 ( :—   4

【8 G Z G RC Y    C R E   A srt n o mioaiso  1l R E O Z K S D, A T R G.dopi  fa n  c   n   o d

pru oy eia

sre t—. q ib u J.hm E gS i 9 , oos lm r  dob ns IE ul r m] C e   n c,9 6 p c ii ] I  

5 (18 7 8 7 15 : 0 — 1   [ 9 I U   K L AR A K, AI A     E u l r m su is o  1 ]T T S E, A K     G K R V G.q i b u   t de  f ii

[ 曹伟 , 9 J 邹时 复. 三波长分 光光度法研究 I, K系数法 测定混 合三 

组 份 I 1 化 学 ,9 3 2 () 3 — 3    分析 J 1 19 ,16: 0 6 3 6

[0 1】曹伟 , 冯永健 . 三波长分光 光度法研究 Ⅲ两测量 波长法提高测定  灵 敏 度 ll 析 测试 学 报 ,9 5 1 ()5 — 7  1 J分 1 9 ,42:4 5 

【 1 U H     .   ve     u l r m i s ge n   h c m o n   l ]B S RA A D A r iw i e ib u    i l  dmu i p u d   e n q ii n n a o

asrt no  n cd nN Z M一  eleJC l is n uf dopi  f mioais  a S 5zoi [.ol d  dS r  o a o t ] o a . A:h s oh m E gA p 2 0 ,2 (/)5 — 1 P yi c e  n  s, 0 3 2 313: 5 6  c

l udasrt nss m [. e i snc e e e gneig 1 9, i i dopi   t s ]R ve     mi nier ,9 5 q   o ye J w i h  ̄ n   1()1 6 1 :-  2

[O 2 1刘静霞 , 中来._ 王 L 酪氨酸和 L 苯丙氨酸双组分吸附平衡研究lJ 一 J.   福州大学学报: 自然科学版,073 ()6 0 64 20 ,54:2 — 2   【1 2 ]郑红 , 中来.一 王 L 色氨酸和 L 苯丙氨酸在 7 2 一 3 树脂上 的吸 附行为 

研 究 『l 品研 究 与 开 发 ,0 0 3 ()5 — 8 J_ 食 2 1 , 1 :4 5  7 收 稿 日期 :0 1 0 — 3 2 1— 7 1 

[2 1】陈女. 丙酮 一 酚水溶液在 活性炭上 的吸 附平 衡研究 [】上海 : 苯 D.   同济大学化学 系,0 7 5 6 2 0 :-  

f3 1 】MAR A JA, R I A, I I I N M,t 1 q i b u  tde  f I    MO E R L C N O   e a. ul r m s is     E ii u o

p eyaa iea dtrs eo  n ec ag eisJ. h m E g h nllnn n yoi  ni — xhn ersn[] C e   n  n o

范文二:氯化血红素与三种芳香族氨基酸的相互作用 投稿:高籊籋

第2 9卷 第O 5期  2 0

1 4 O年5月  

师山 学 院学范  报

J o ur n al   o f  L es ha n   N or mal   n iU e v s rit y

Vo 1 . 92. No . 0 5

 Mav . 02 14  

化血氯素红三与种香旗氨芳酸的基互作用 

刘 相,凡  李琼  (

乐 山师学范 化院学学,院 川 四乐山6 1 04 00 )  

摘:要 用利荧光光 谱研究 法氯化了红 血素(He m i ) n与 色酸 (氨T r p)、 酪 酸氨( T y r ) ̄1 苯丙1氨 酸( P h e 的相)互作用 , 用 

t em— V o l emr 方 程 L i 、 ne we a evr -Bu rk 方 程确定了其荧光猝灭机 为静理猝灭 ,态得到 不了同温 度和p H条 件下 的化血红素 

氯与氨基酸作

用的结合数 常 结、合点数位 作用体系及的 力热参 学数。  键词 关: 氯化血红 ; 素氨色酸 酪;酸氨; 苯丙氨酸; 荧光 光 谱 ;合结常数; 结合 点数位 

中图分号 : 0类6 5 7. 3  文 标志献码: A  文编号 :章1 0 0 — 9 6 8 6 6 2(0 41) 05 0— 01 9 — 40 

The

I  n te a r tc ion  B  et e e n w  Hemi n a  d n T r ypt poha n, 

  1 ●。、     _ y r o si  ‘ ne   a n ’ l ' d  l’   l e n y l ’ al ’a nl 。 n e L I

  UF a n L ,I  Q i n o  g( S

hco o   l o   f h C mi e tsr y , L es h an N o r m a l  U in ve rs i y ,t Les h a n  Si h c u an  6 1 4 0 00, C ihn a )  

bAs t r ac :t h T e i nt e r a c ti o n  o  f e Himn  w t i   Th ry t opp h a n , Tyr o s i e   n an d   Ph e n y la a nli n   e a s  wi n v s e itg a et d  b y   fl o ru es c e n ec   ps c e rto s c o p y me t  ohd T . he  r e s u lts   h o sw   h ta t   hte   eH mi  n s r to gn l y q u en c he s t he  lf u o er s e cn c   e f o T  r p yt o ph an , T yro s in e  a nd   P

h ne lya l an i n .I te  ha s  b ee n  p or v ed   t h a t  th e   l f uo r e s c en c e   q u e n ch in g  m e ch n a ism   bel o n gs   o  t t he  s t t aic  q u en ch i g   b yn  St e r -n V o le mr  e u a tq io n  an d  L i ne w e a ve r —B ruk   e qua t i o nA.c co r di ng  t o   iLn ew aev e r— Bur  ekq u a it on  a d  t nh e ro d m n yam i sc  q ue a t i on t,h eb i n d i n gc o   snt an t s, b i n i dng s  a et s   n a  dt he

r m od yn a i cms   p a ar e m t er s we  re   ob tai n d e  a t  d if f e r en t   etmp e r ta u re s  a n d  p   i nH  t he a  que uos   sol u t o in  a n d i     tn h  e s ol ut i n s   o of  eG m in i   s ruf a t ac t n .s  K ey  W o rd s :H em ni Tr ;yp t o p ha n ; y r T s oi en Ph ;en y la l nai n e; F l uo r se ce c en  Sp e rcot s oc p y;Bi n id ng  Nu me rbs ;B n d iin g C on t s a nts  

氯化 血 红素 ( eHm n ) i是一 个具 有 卟啉 结构 的  小 分 , 由卟子 啉中 四个吡 咯 上 的氮环原子 与一 

药 血的 有化机 合物, 是 吸 率收 高 生的物态 铁剂 。 色 氨 酸(  T rp ) 、 氨酸 酪 (T y )r、 苯 丙氨 酸 (P he 为人体)所  必 需的 基氨酸 , 合是成人 体重 要 的神经递 质 、上肾

 

亚铁子离配位合结 ,其可用以作铁强化剂及贫抗 

收 稿

日 期: 02 1 —3 21 —2 5  

者作介 : 简刘( 凡1 69   ), , 四川成都人 男高级。实验 ,师 研 究向方: 表 面学化化学及力动学;李琼 1( 97 6一) , 女 四川南,充 

人 。高级实验 师 ,究方向: 分 研子 别 。 识 

素、 腺去甲 肾上腺素 、 甲 状腺素 及黑 色 等激素 的  前体素或重要 料 ,原 如 果 这些 氨

基 酸 缺乏 时 ,将 影 响脑 代 谢以及 导 致化病 或白苯 酮尿 症等疾 病 发的

 生【1 _ ] 。许 倩 ] 影研等 究 了P (1 (1 I ) 、Cr (H I ) L 、a( )m、 C   e () Ⅲ与色 氨 酸、 酪酸 氨 、丙 苯酸 的氨互 作相  用,

而 化 氯血红 素与色 氨 酸等的研 究 还 未 报道见 。因

 此研

氯究血红化素与芳香族氨基酸 相的作互用 ,  可以探 氯讨化红血素色氨酸等与的作能用和结 

构 特点力 , 疾病 为 的治 疗 、研 究药物 作 机 用 及药制  物

^L l -^ J 

^ Lm 】

图1  H e  mi 对Tnr 口 《 A   - 口 T  By】 荧的光灭 ( [ T猝r ]p = 2. 0 x l0 -  ̄  o

t 1 .oL -   。 [ T ry] = 4. 1  ̄ 7 0  1o ot 1 . L -  , H[e i nm ]= 0 , 0 6.7 , 1 .33 , 2. 0 0 ,  2.6 7 3,. 3 3 。4 .0 0 x1 0   o ot1 . L - ‘ , pH = . 0 70, 29 8 )K

 分子

设等计提供重要信的息 本文应。用光荧谱 光 法不在同的温 条 度件 下究 研氯了 化红血素 与色  氨酸等氨 基酸 的互 作相用以 及表 面 活 性剂对 作 用 

体系 的 影 响, 用利 tS e r n — oV lm er 程方、 L i n e w ea ev r —  B u r k方 及程热 学力方 程对 实 数据 进 行验处 理 ,  

荧 光得 猝灭 分 为 动态猝 灭 和静态 猝 灭。 如 果  e H imn 对 基氨 酸荧 光猝 灭 机 理 动 为 猝态 灭 机理 , 即遵循 S t e rn — Vo lme r 程 方: 

F o/ F I + K q=  ̄ - o[ Q  ]= l  +[ Q   ] 即

,  

(1 ) ( 2  )  

到了

H e or i 和色氨酸等n用作 猝的灭用机理作为静  猝灭 以态二及者 之间结的合 常数、 结合点 位数及  热力学参 数 。

 =K v s[Q   ]  

中式 R和 分F别 为 未 入加 加 入 H e和m in 的  荧强度 , K 光 sv 为动态 猝灭 常 数, 为 散 射 碰 猝 撞

实验 部分 1

.1 仪 器 与剂 试

速常数率, 丁 。没有猝为剂存在灭下荧分子平光 均 寿 命 ( lx O- s )S, Q  为猝 灭剂H e m in的浓度。以   ( F o—F ), F ~ Q。 作 图 , 得到色 酸 氨 S t的 rem - Vo l m r  

e曲线 (如 2 图) 通 ,过 对实 数验 据进行 线 性 拟 合 得到 线 回归性 方 程( 尺 ≥0 .  9 8) , 此由得

到动 态猝灭 常  数点  、 射散碰撞 猝灭 速率常 数   K及以 荧光 半 

猝浓 灭 度 Q此 ,见表 1。

 C ar y   cEl i p e s 荧分 光 光度 光计( 带 恒装 温 置 ,

美  国VA R IA N公 ) ,司 e as 酸y度 计 (特勒梅( 上 )  海

器 有责限 公 司 ) 任 。 

氯化 血 红素 (H me ni, 北 京百灵 威 公 司 , 三 )  甲基 羟氨 基 烷 (甲T r i s) ,盐 酸, 色氨 酸(成 化都 试 学剂 

)厂, 氨 酪酸 苯丙 氨、 (酸 上海 化学 试 剂 厂 ) 均为 分  析 纯, 实 验用水 为次三蒸馏 水。

  1 .2实验 方 法 

在不 同的反应温 度下 , Kq ( X 1 0 ” L. m o l 

>  >

0 . x10   O L. m ol ・ S - 1 ( 大 散最射碰 撞 灭速 率 常 数猝) ,

取   1.5 m0L Tr is HC —1 0 ( .1 mo / L ) l p缓 H溶冲 液于  1 . O mc比色皿 ,加中入 不同 体 的积基氨 酸 液溶 , 

并并 K且q ,2 9 8K > qK, 姗 即 ,  随温度升高而的小 减 这 ,表 明H mei n对 基氨 酸荧的 猝 灭光应 不是 子 间分 碰 而引起 的撞动荧态光猝 灭 而应,该是 He m in氨与

 基酸 合 结形成 二 元 复 合 而物引 起 的 静 态 光荧  

加 水 释稀至 3 0 . mL0 , 加入 再一定 量 H的 em n溶 i 液(

≤ 60 1x L) 恒, 5 a r温 i n, 2以7 3 m、 n 270 n m 2 、 5 n 8m   别为分色酸 、氨酪 氨 酸、 苯 丙氨酸 激发 波 长, 发 射 狭 缝 和  激 发缝 均为 5狭 n m测,定 系溶 列 的液 光荧发 

射谱 图 光,并 测量 光 荧值峰的 荧 光 度 。 强 

灭 在相同, p H值和的温度时 , 其猝 灭效为率T r p  体 > T系 r y体 >系P h e 系。 体 2  .3 H e im n 与基氨酸作 用 的结 常合 、结数 合 位点  数与 力学热参数 

结 果与 讨 论

  2 1.  Hem ni氨基与酸 作 用 的荧光 发 射光 

色谱 氨酸、酪氨 及酸丙 苯氨酸的 耵大 结键构   而有具强度不的荧同光, 固定氨基酸的 浓 度, 而不断 加 大 溶液中 的H mi en浓度 时 , 氨酸色、 酪氨 酸及 苯  丙氨 酸 别 分在3 55 mn 、3 0 2 nm、 8 2 2 nm 处荧 光 射 

峰发强度逐 渐 弱减( 如 1图 )。

2   .2  He o ri 和n 氨酸基 用作的机理 

2 0

 

q t 1( 矿n . l。 L ),

 l n

目t 0   l

/L ) 

图 2   p H7 .0 0 时 水溶 液中   图3   H p 7 .00 时 水 液 中溶  H em i n与 色 酸氨 / 苯 丙氨 酸作  eH m ni 与 色氨 / 酸酪氨 酸作   的用St e r—m Vo lme r曲   线的 用Li e w n ae ve —r B ur k曲 线

 

表 1 水溶液 中 H emi 与n Tr p T y r// h P的动态e猝灭数常 K( ) 散射和撞碰猝灭率速数( K常)  

c on di t io s n [: T r ] p 2 = 0. lx0   m o .1 ~ ,L [ yT =d4 .1 7 x1   o0 t 1 o.L ~[ P he] = 1 . 7 6 x 10   om1 L.一 , [H me ni] - 0 . 6 , 7 .13 3 , 2. 0 , 0 2 6.7 , 3 3 3. ,4 . 00 x1 0   m

o 1.L 1   -p =H 7 . 0 .  

表2 水溶液中H e i m和n Tr p T/ yr/ Ph 的结e合位数点 结、合数常热力及学参数 

o n d i c i t n so: [ r T ]p= 2 .0x 10 -S m o 1 . L ~ ,[T y r ] = 4 . 17 x1 0  o t o1 . L~ [P e h =]1 . 6 x 7 10。 om 1 L .~ [, H e i n m =]0 , 0.6 7 ,1. 3 3, 2 . 0 0 , 2. 76, 3 3 .3 , .40 0  

1x0 -S om 1.L -‘  

H em i 与 n 氨基 酸的 荧 光 猝 灭 为 静 动 态猝灭   时 ,即循遵L i n e w e v ea —r Bu r k方 程:  l

n   =l  + n l [ Qn  ]  ( )  

3AG 一= /RI K nH — ATS  

4 )

 ln ‘   a K 2)= 1 一  ) × A H  

( 5)

而  对 于 度 温 化 不变大 的 反 体 应 ,系 反应  

的△   可看以 为作 个 常一数 He。 min 与氨 基酸 结合 后 的日, △△及 △G的S算 计果结 如表 2 所示。  

式 中  为结 合 位点 数,   为He mi n 氨和基酸  的结合常数 , I以 n  ( 表2

) 。  

I~ n [  Q] 作 图( 图 )3( r≥  

. 09 5 90 ), 可即 计 出结算 位合 点  和数结合 常数  合结常数  K较大 ,说 明H m i en与氨基酸 之   间较有强 的 合结力 氯。化血红 素 中 个四 吡咯环 上 的  原氮 子 与个一亚铁 离子 配位 结合 而余,下 两个的  空 的 2d ps s杂的化 轨 道可以接 受 基氨酸 中可

提  供

对于 分子 自身间 结合 力 性 的质热 力学  规  律 :A H>0 , SA >0 为水 作疏用 力 ;A <S0 , A H 0<  为氢

键和范德 力 ; 华AH< 0 ,S A >为0 电引力 。 从静 表 2 可见 A,G 0<, 该H e i nm 与氨基 酸 合结反 应是  一

自能 由低降 自发 过 的程 ;HA<0 , 该 反 应放是 

热反 ,温 度 升应高 不利 反于应 进的 ; 行S < 0 ,A  AH< 则两 者0 分 间子可能存在范 德华 力  

孤对 。子电的 0或 原N子成配形位 键从,而 得  H使 em in 氨 与酸 基的 结较合 为 紧密,结 合常数 (K )   Ta rp体系 > y Tr体系 > P eh系体 ,这与其 猝半 灭浓度 

的小 大 是一致也 的 。He m ni 氨基 酸与的 结 合 数  常温随度 的升 高而 减小 即,溶 温度 液 高升 体,系 中 分 获子得 的 能 量 增多 ,分 子 的 热 运 加 动剧, 使得

 

3结 论  在

验实 条件 下 , H ei mn与T rp / T y r/ P eh作 的用 研 究明表: 水溶在中液 ,作用 体系 的△ <G0 ,e Hm i  

与T n pr /T yr/ P h e 结 合的是 一 个 由 能 自 降低 的发自 

过 ,程AH 0< 该反,是应放热反应 , 温 度升 高 不利 于 应反的 进 行 , 而△H<0 , S A 0< ,H em i n与 T r p/  

He mi n 与 氨酸的基合较结为不易,而使其 合常结 数减小 。

根 据 不温同度 下的结 合 常数 可以计算 得 到反

 

T yr /P h 分 子e间 能 存可在 范华德 力  。

(下转 第 8页3 ) 

应热力的参学。即: 数

 2

 

综的 合用应 模型 , 系统该 文 从档语义分 析 角 度的 ,将 统 计 和 语义两 面方因 素进行 了 有 结 合效 在实。验   传 中统方法 的滤 准 率 和滤 率全 分别 为 0 .8 95 和0. 8 4 1 ,而本 文 提 出 方的法 的 滤 准率 滤和全 率分 为别0 . 7 69 

和0 .

9 4 2, 分提别 了大约升9 1.%和 .9 9 。 由此%以可证明 本文 出的不提 良信过滤息统较传统系的息信滤过 系 在滤全率和滤准率方面都有统一定的改进了  

表 1。 不 良 信 息 滤过系统 性能 的 比较

由表 1 的实验数 可知 , 本据文出提基的语义分析 于的 良不信息滤系过统一是种合混模型, 因较传此   的统 于基向量 空 的不间 信 良过 息 系滤统在滤 准 率和滤 全方率 面都 得 了一定到的改 善 。  

语结

 本提出的不文信良息滤系统过是传在的统基

于向量空间型的模滤过系基统上 础通,过建非构法文 档 规则库  从 ,对而文档 内 容进行 语 分义 析 实 。验果 证 结明文本提 出 不的 良 信过息滤 统较 系传 统的 滤 过系  在统全滤率和滤率都有准 了定的一改进由。文本提出于的向中文面域的领不良信息 过滤系统及涉面相  广当, 因 此有多地方很待进一步改进有。 今后 的工作主要有 : 1() 进已有改中文的分词法 以提高中算文分

词 的准  确 ,性从而 增加 信 息过滤 的准确 率 ; ( ) 2针对 文中语 法 纷 繁 复杂, 尽 可 构 能建合适 的语 义规 则 来库 

非法述息 , 信而提从高信过滤的准确率。  息参考

文献  : (1 lN滨 ,雷国华 , 于飞  等燕. 于基义语析分的网络 良不息过滤系统研信究[J 1 . 算机计应与软件用,2 0 1 ,0 2 ( 2)7 :2 83 — 2 85 .  

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责任 编辑 : 王 兴全]  

(上接 第 2 1页  

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责任辑编 :书李华 ] 3

8  

范文三:水溶液中几种芳香族氨基酸_自堆叠作用 投稿:孔拓拔

物理化学学报(WuliHuaxueXuebao)

April[Article]

ActaPhys.-Chim.Sin.,2009,25(4):729-734

729

www.whxb.pku.edu.cn

水溶液中几种芳香族氨基酸π-π自堆叠作用

胡新根1,*

朱玉青1

生1

2

张贺娟1刘飞1于丽2

250100)

(1温州大学化学与材料科学学院,浙江温州325027;山东大学胶体与界面化学教育部重点实验室,济南

摘要:利用精密的流动混合微量热法测定了298.15K时D/L-色氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸和L-苯丙氨酸四种天然芳香族氨基酸水溶液的稀释焓,根据所建立的拟等步自堆叠作用的化学模型对实验数据进行了处理,计算得到模型参数KΔHm.该化学作用参数与McMillan-Mayer理论模型中的焓对作用系数具有高度一致性,即hxx=KΔHm.结合文献报道的结果,认为芳核π-π自堆叠作用在本质上是一种特殊的疏水-疏水作用,一般表现为吸热效应;取代基空间位阻、芳核以外部分的静电、氢键和手性选择性作用等对芳核π-π自堆叠作用有显著影响;组合参数KΔHm实际上描述了芳核π-π自堆叠作用平衡及焓变的综合效应.关键词:芳香族氨基酸;中图分类号:O642

π-π自堆叠;

稀释焓;

微量热法;

化学作用模型

Aromaticπ-πSelf-StackingofSomeAromaticAminoAcidsin

AqueousSolutions

HUXin-Gen1,*

ZHUYu-Qing1

YUSheng1

ZHANGHe-Juan1

LIUFei1

YULi2

(1CollegeofChemistryandMaterialsEngineering,WenzhouUniversity,Wenzhou325027,ZhejiangProvince,P.R.China;2KeyLaboratoryforColloidandInterfaceChemistryoftheMinistryofEducation,ShandongUniversity,Jinan250100,P.R.China)

Abstract:DilutionenthalpiesofsomearomaticaminoacidssuchasD/L-α-tryptophan,L-α-tryptophan,L-α-tyrosineandL-α-phenylalanineinaqueoussolutionsat298.15Kweredeterminedbysensitivemixing-flowmicrocalorimetry.Achemicalinteractionmodelforquasi-isodemicself-stackingwasproposedandusedtoprocessthecalorimetricdatafromwhichthemodelparameterKΔHmwascalculated.Thechemicalinteractionparameter(KΔHm)agreeswellwithandprovidesgoodinsightsintothepairwiseenthalpicinteractioncoefficient(hxx)intheMcMillan-MayerapproachfortheexistenceoftheequationKΔHm=hxx.Combinedwithresultsfromliteratureweconsideredthataromaticπ-πself-stackingisessentiallyakindofspecialhydrophobicinteractionmanifestingcommonlyasanendothermiceffect.Noteworthyeffectsarisingfromsubstituenthindrance,electrostaticinteraction,hydrogenbondingandchiralrecognitionwhicharedirectedawayfromthearomaticcoreexertonaromaticπ-πself-stacking.Innature,thecompositeparameterKΔHmdescribesacomplexeffectbetweentheequilibriumandanenthalpicchangeofaromaticπ-πself-stacking.

KeyWords:Aromaticaminoacid;

interactionmodel

π-πself-stacking;

Dilutionenthalpy;

Microcalorimetry;Chemical

芳香族分子间的相互作用(π-π,OH-π,NH-π和阳离子-π)在化学和生物学的许多领域都非常重要,这些相互作用控制了芳香族分子的晶体结构、生物系统的稳定性以及分子识别过程[1-4].在蛋白质

*

折叠过程中,氨基酸残基之间的相互作用是一个决定性的因素[5],对认识蛋白质的高级结构非常关键.在各种氨基酸残基中,极性基团间的氢键作用和芳香性残基间可能的π-π相互作用对决定蛋白质的

Received:October17,2008;Revised:January9,2009;PublishedonWeb:February18,2009.Correspondingauthor.Email:hxgwzu@126.com.

鬁EditorialofficeofActaPhysico-ChimicaSinica

国家自然科学基金(20673077)、胶体与界面化学教育部重点实验室(山东大学)开放课题(200506)资助项目

730

ActaPhys.-Chim.Sin.,2009

Vol.25

结构起着重要影响[6,7].Burley等[8]在对一组34个蛋白质的研究中发现,大约60%的芳香性侧链涉及了π-π相互作用,而80%的这种作用通过联系蛋白质二级结构的不同要素对稳定其三级结构有贡献.另外,π-π相互作用在与化学和生化过程相关的质子偶合电子转移反应(PCET)中也普遍存在[9].这类弱相互作用的大小和物理起源对理解各种分子聚集体的结构与性质是必需的,同时对发展材料和药物设计策略也相当重要的.

在理论上进行模拟计算是研究芳香族分子上述弱相互作用的一种重要途径[5],而在实验上人们往往利用合适的分子模型系统进行研究[10,11].近年来,对生物体系中弱的非键相互作用的能量学(energetics)研究引起了人们的重视[12-17].作为研究工作的继续[18],本文建立了一种描述水溶液中芳香族分子拟等步的π-π自堆叠作用的化学模型,用于处理D/L-色氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸和L-苯丙氨酸水溶液的稀释焓实验数据,并结合文献报道的结果,对芳核π-π自堆叠作用的焓效应及其影响因素作了讨论.

1α=b(M)=(5a)

t223i聚体:

i(K2K3…Ki-1Ki)[b(M)]i-1

αi=ib(Mi)=,

t223i叟2(5b)

假定M分子的二聚作用是主要的,其平衡常数K2较大;但在二聚之后,每一步π-π自堆叠作用的模式和强度都相同,可看作是拟等步堆叠(quasi-isodemicpacking),即假定每一步堆叠作用的平衡常数和摩尔反应焓变都相等:

K=K2/β=K3=K4=…=Ki,i叟3ΔHm=ΔH2=ΔH3=…=ΔHi,i叟3

(6)(7)

式中β表示二聚和三聚作用的强度比.则式(3)和(4)分别可变为

2

ΔdilH∞m=-βKΔHm[b(M)]{1+2Kb(M)+

3K2[b(M)]2+…}/bt

(8)

bt=b(M){1+2βKb(M)+3βK2[b(M)]2+…}(9)若以无限稀释溶液为参考态,则溶液的相对表观摩尔焓LΦ为

LΦ=-ΔdilH∞·m=βKΔHmb(M)

(1+2Kb(M)+3K2[b(M)]2+…)/

(1+2βKb(M)+3βK2[b(M)]2+…)(10)

在稀溶液中,若Kb(M)垲1,βKb(M)垲1,则如下展开式成立:

[1-Kb(M)]-2=1+2Kb(M)+3K2[b(M)]2+…β[1-Kb(M)]-2-β+1=1+2βKb(M)+

3βK2[b(M)]2+…故由式(9)得

bt=b(M){β[1-Kb(M)]-2-β+1}由式(10)得

LΦ=βKΔHm

[b(M)]2

t(13)(11a)(11b)(12)

1芳核π-π自堆叠作用的化学模型

对于芳香族溶质M的π-π自堆叠作用,假设

可视同如下化学反应[18]:

Mi-1+M=Mi,i叟2(1)

b(Mi)b(Mi)Ki==,i叟2(2)i-123i-1式中b(Mi)为物种Mi的质量摩尔浓度.设反应的摩尔焓变为ΔHm,i,平衡常数为Ki,并假定溶液的稀释过程热效应主要是缔合物种Mi的解堆叠作用产生的,则对于一定物质的量n的溶质M在质量为ms的溶剂中无限稀释的稀释焓(以每kg溶剂计)为

ΔdilH∞=nΔdilH∞m

s

=-[b(M2)ΔHm,2+b(M3)(ΔHm,2+ΔHm,3)+…]

=-{K2[b(M)]2ΔHm,2+K2K3[b(M)]3(ΔHm,2+ΔHm,3)+…}(3)

式中,ΔdilH∞m为每摩尔溶质无限稀释的稀释焓.

溶液的总质量摩尔浓度bt为

bt=n/ms=b(M)+2b(M2)+3b(M3)+…=b(M)+2K2[b(M)]2+3K2K3[b(M)]3+…(4)=b(M){1+2K2[b(M)]+3K2K3[b(M)]2+…}定义物种Mi的配分函数(权重分数)为

单体:

=KΔHm{1-βK[1-βKb(M)]2bt}2bt

式(13)展开后得到

LΦ=KΔHmbt[1-2βKbt+5βK2b2t+…](14)对于稀溶液(bt垲1mol·kg-1)或较弱的自堆叠作用(K垲1kg·mol-1),式(13)中右边的高次项可以忽略.则对任意的稀释过程(bi→bf),其摩尔稀释焓为

ΔdilHm(bi→bf)=LΦ(bf)-LΦ(bi)=KΔHm(bf-bi)-2333

2βK2ΔHm(b2(15)f-bi)+5βKΔHm(bf-bi)+…

由实验测得的摩尔稀释焓ΔdilHm(bi→bf),根据式(15)进行多元线性回归分析,可以求得KΔHm的值.

No.4

胡新根等:水溶液中几种芳香族氨基酸π-π自堆叠作用

731

KΔHm称为对分子化学作用参数(pairwisemolecularchemicalinteractionparameter).

稳定值后记录P值.质量流速f1和f2则以称重法进行标定,流速精度优于0.1%.

总体积流速(v1+v2)对电标定值有较大影响,在不同总流速下测定时必须重新进行电标定.实验发现,总体积流速不变,改变进样流速比,热标定值基本不变.通过调整两台蠕动泵的体积流速比(v1∶v2)就可以方便地改变稀释比,而不必每次进行电标定.另外,总流速在40mL·h-1以下时,测得KCl水溶液的稀释焓与总体积流速呈线性关系,可以直线外推至零,说明在这一流速以下两种试液能充分混合稀释.实验中控制体积流速比(v1∶v2)为20∶10,15∶15,10∶20,总流速为30,单位为mL·h-1.

稀释焓的计算公式为ΔdilHm=P/(cif2)(16)稀释后溶液的浓度为

bf=bif2/[f1(biM2+1)+f2](17)式中,f2和f1为溶液和溶剂的质量流速(mg·s-1),bi和bf为溶液稀释前和稀释后的质量摩尔浓度(mol·kg-1),ci为以每kg溶液计的溶液的稀释前浓度(mol·kg-1),M2为溶质的摩尔质量(kg·mol-1).每个浓度下的稀释热功率P都平行测定三次,取其平均值根据式(16)计算摩尔稀释焓.

2

2.1

实验部分

仪器与试剂

采用LKB-2277BioActivityMonitor精密微热量计的流动混合检测系统测量稀释焓.待测溶液和纯溶剂分别由两台微蠕动泵(LKBBROMMA2132)输入热量计的混合池,在池中迅速混合、反应,然后流出,在流动过程中,反应的热功率被检测,经放大、显示、记录.仪器的温度控制精度为0.0005K,热功率测量精度优于0.2%,检测极限为2μW.

实验所用D/L-色氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸和L-苯丙氨酸均为Sigma试剂,使用前用甲醇-水混合溶剂重结晶处理并真空干燥至少48h.L-酪氨酸因为在中性条件下在水中溶解度太小,稀释热很小,所以没有进行测定.溶液配制用水为二次重蒸水.2.2方法与步骤

当热量计恒温系统及检测系统达到热平衡后,用溶剂水设定基线,进行电标定.然后,溶液和溶剂分别通过一对蠕动泵以一定体积流速比(v1∶v2)泵入热量计的混合池.当稀释过程产生的热功率(P)达到

表1298.15K时D/L-色氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸和L-苯丙氨酸水溶液的摩尔稀释焓

Table1MolardilutionenthalpiesofaqueoussolutionsofD/L-α-tryptophan,L-α-tryptophanL-α-histidineand

L-α-phenylalanineat298.18K

bibf

-1

(mol·kg)(mol·kg-1)

bfΔdilHm,expbi

-1

·kg)(mol

ΔdilHm,exp

(kJ·mol-1)bf

(mol·kg)-1

bi

bfbiΔdilHm,exp

ΔdilHm,exp

(kJ·mol-1)

L-α-phenylalanineL-α-histidineD/L-α-tryptophanL-α-tryptophan

0.1021-61.06(0.41)0.15010.094528.25(0.21)0.13970.05110.033422.97(0.19)0.02110.0138-21.09(0.13)

0.0661-104.50(0.82)0.15010.065046.85(0.33)0.13970.05110.023236.18(0.32)0.02110.0096-33.17(0.21)

0.15010.0478-125.80(0.97)0.047558.11(0.45)0.13970.05110.017343.85(0.39)0.02110.0072-40.21(0.32)

0.0755-43.28(0.34)0.11130.075322.57(0.12)0.11130.04520.029420.24(0.13)0.01820.0119-18.41(0.14)

0.0489-74.43(0.55)0.11130.051837.14(0.26)0.11130.04520.020431.87(0.28)0.01820.0083-28.68(0.17)

0.0353-89.86(0.49)0.11130.037946.05(0.36)0.11130.04520.015238.63(0.24)0.01820.0062-34.76(0.25)

0.0494-27.17(0.12)0.07270.064419.39(0.07)0.09520.04050.026218.05(0.11)0.01650.0108-16.72(0.08)

0.0325-46.98(0.21)0.07270.044332.15(0.22)0.09520.04050.018228.43(0.22)0.01650.0075-26.26(0.19)

0.0231-56.89(0.33)0.07270.032440.02(0.18)0.09520.04050.013634.46(0.27)0.01650.0056-31.31(0.24)

0.0352-18.87(0.12)0.05210.054216.24(0.11)0.08010.03550.022915.78(0.09)0.01440.0094-14.61(0.06)

0.0228-32.73(0.24)0.05210.037326.86(0.14)0.08010.03550.015924.85(0.21)0.01440.0065-22.69(0.16)

0.0165-39.77(0.18)0.05210.027233.34(0.23)0.08010.03550.011930.12(0.25)0.01440.0049-27.58(0.19)

0.0332-17.75(0.07)0.04880.046814.03(0.08)0.06920.02990.019513.46(0.07)0.01210.0079-12.31(0.11)

0.0215-30.81(0.26)0.04880.032223.21(0.12)0.06920.02990.013621.20(0.18)0.01210.0055-19.17(0.09)

0.0155-37.38(0.27)0.04880.023528.27(0.21)0.06920.02990.010125.69(0.13)0.01210.0041-23.11(0.14)

0.0304-16.21(0.06)0.04520.035310.56(0.08)0.05210.02540.016411.28(0.05)0.01070.0072-10.61(0.09)

0.0197-28.13(0.17)0.04520.024217.47(0.11)0.05210.02540.011417.76(0.07)0.01070.0049-16.86(0.08)

0.0142-34.13(0.15)0.04520.017721.56(0.16)0.05210.02540.008521.52(0.12)0.01070.0036-20.33(0.13)

0.0273-14.46(0.07)9.21(0.07)0.04090.03090.0456-8.95(0.07)0.02030.01319.06(0.04)0.00890.0058

0.0177-25.12(0.09)0.04090.021215.29(0.11)0.04560.02030.009114.26(0.09)0.00890.0043-14.02(0.11)

0.0128-30.55(0.16)0.04090.015519.05(0.13)0.04560.02030.006817.29(0.11)0.00890.0034-17.31(0.13)

biandbfaretheinitialandfinalmolalitiesofsolutes.Thevaluesinparenthesesaretheexperimentalerrors.

732

ActaPhys.-Chim.Sin.,2009

Vol.25

3结果与讨论

表2

D/L-色氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸和L-苯丙氨酸在298.15K时不同质量摩尔浓度的摩尔稀释焓数据见表1.根据式(15)进行多元线性回归分析,求得KΔHm的值,见表2.

根据McMillan-Mayer统计热力学理论[19],非电解质水溶液的稀释焓常用以下方程进行处理:

2

ΔdilHm=hxx(bf-bi)+hxxx(b2(18)f-bi)+…

对比方程(18)和(15),得到hxx=KΔHm,说明本文的化学作用参数KΔHm与McMillan-Mayer理论中的焓对作用系数hxx之间具有高度的一致性.表2中还列举了根据文献报道的一些芳香族非电解质在水中的稀释焓计算得到的KΔHm,部分直接引用了hxx的值.

在McMillan-Mayer理论中,hxx被认为是溶剂介入的溶质-溶质相互作用(solvent-mediatedsolute-soluteinteraction)在焓效应上的一种度量:

鄣(g/T)hxx==g+Ts

鄣(1/T)pxxxx

298.15K时一些芳香族非电解质在水中的化学作用

参数(KΔHm)

Table2Chemicalinteractionparameters(KΔHm)ofsomearomaticnonelectrolytesinwaterat298.15K

AromaticcompoundLorD/L-α-Tryptophan

hxx=KΔHm/(J·kg·mol-2)D-L:-1282(8)[thiswork]

-1368(25)[24]

L-L:2864(24)[thiswork]

2900(170)[25]

L-α-histidine

-634(5)[thiswork]-631(7)[24]-620(10)[25]

L-phenylalanine

1074(10)[thiswork]1229(29)[24]1140(30)[25]

L-phenylalanine(inacidicsolution)

2750(238)[12]

L-tyrosine(inacidicsolution)563(75)[12]

02

)RTM1-(EΦ

-g=uxx+λRTxx

1

鄣鄣

(19)

D-p-hydroxyphenylglycine

-726(8)[16]

式(19)中,uxx是超额内能的第二维里系数,λ是溶0

剂的热膨胀系数,EΦ是溶质的标准偏摩尔膨胀率,M1和V01分别是溶剂的摩尔质量和体积.在理论上,焓对作用系数hxx和自由能对作用系数gxx可通过对两个溶剂化溶质分子的平均力势(potentialofmeanforce,PMF)[19]积分求得;在混合溶剂中平均力势不仅与两个溶质分子的取向有关,而且还与所有水分子和共溶剂分子的取向有关.可见,hxx不仅反映了溶质-溶质直接作用,而且反映了无限稀释时由于溶质-溶剂、溶质-共溶剂、溶剂-共溶剂相互作用的重新分布引起的影响,因此hxx实际上是综合反映了溶质-溶质、溶质-溶剂各种相互作用的复杂效应.尽管McMillan-Mayer理论在很多情况下运用是成功的,但在hxx的理论解释和理论计算上还存在相当多的困难.

根据本文提出的化学作用模型,由于hxx=KΔHm,因此hxx实际上既包含了对分子作用过程(pairwisemolecularinteraction,PMI)中的化学平衡因素(ΔGm=-RTlnK),又包含了热效应因素(ΔHm).因此借助化学作用模型可以更好地理解McMillan-Mayer理论中hxx的物理意义,尤其对于存在较强非键作用的分子体系,如疏水缔合、氢键缔合和π-π堆叠等.

根据hxx=KΔHm,由于平衡常数K>0,因此hxx

phenol816(8)[12]

4-hydroxyphenylaceticacid-2032(134)[12]

pyridine1192[14]

o-methylpyridine(α-picoline)598[14]

m-methylpyridine(β-picoline)2828[14]

p-methylpyridine(γ-picoline)3577[14]

Thevaluesinparenthesesaretheexperimentalerrors.

值的符号由热效应ΔHm来决定.当ΔHm>0时,hxx>0,例如在疏水-疏水作用或亲水-疏水作用占优势的情况下;当ΔHm

No.4

胡新根等:水溶液中几种芳香族氨基酸π-π自堆叠作用

733

素,例如静电作用、氢键、取代基位阻、手性识别等,就会显著影响hxx的绝对值大小.

芳核的π-π堆叠作用在本质上包含了vanderWaals、疏水和静电作用[20].每一种成分的相对贡献和大小,以及芳核采取何种几何模式进行堆叠与芳核本身的结构与性质有关[10].由于包含了疏水成分,因此它是一种非常令人感兴趣的分子识别要素;同时如果其中的静电成分比较显著,这种作用还具有选择性.Hunter等[21]在这种相互作用的静电成分基础上提出了几种几何堆叠构型(图1),认为静电成分是芳核的四极矩引起的.比如苯环,虽然没有净的偶极,但有非偶的电荷分布,在其环面上电子密度较大,而在其周边上较小,从而产生四极矩.三种可能的堆叠几何构型分别是边-面型(edge-to-face)、偏置型(offset)和面-面型(face-to-face),环表面的覆盖程度依次增大.当一个或两个环面上的电子密度较低时,第二种模式就比较常见.第三种模式常见于供体-受体作用,以及具有相反四极矩的化合物,此时环面是相互吸引的.例如苯-六氟苯的相互作用,根据计算具有-15.5kJ·mol-1的稳定化能[22],其中静电成分有着不可忽视的贡献[23].

本文认为,以芳环(包括芳杂环)为中心的π-π堆叠作用,虽然其成分比较复杂,但仍然可以看作是一种特殊的疏水-疏水作用,其内在的vanderWaals力和静电作用成分对疏水作用具有协同效应.因此芳核的π-π堆叠作用一般都表现为吸热效应(KΔHm>0),除非对分子作用过程的疏水协同性遭到严重的取代基空间阻碍,或者遭受芳核以外部分的静电、氢键等作用的破坏,或者由于芳核以外部分存在手性中心而受到手性选择作用的影响.如表2所示,纯水中L-苯丙氨酸的KΔHm值是一个较大的正值.其对分子作用过程,一方面因为分子具有较大的疏水区域(C6H5CH2—),所以疏水-疏水作用占绝对优势;而另一方面,由于氨基酸两性离子所带

负电荷头基之间静电作用的存在,因此也可以的正、

大大降低同手性分子间(L-L)疏水作用的协同性.与在中性溶液中相比,L-苯丙氨酸在酸性溶液中随着羧基的质子化,所带负电荷消失,对分子作用过程中疏水协同性反而增强,表现为较大的吸热效应,因此其KΔHm是一个更大的正值.同在酸性溶液中,L-酪氨酸因为比苯丙氨酸在芳环上多了一个—OH官能团,与水分子之间可以形成氢键,使两性离子在对分子作用过程中的疏水协同性进一步降低,吸热效应更小,所以KΔHm值也较小.尤其有意思的是,D/L-色氨酸与L-色氨酸的KΔHm值出现了反号.在同手性情况下(L-L),KΔHm是一个很大的正值((2864±24)J·kg·mol-2);而在消旋情况下(D-L),KΔHm是一个较大的负值(-(1282±8)J·kg·mol-2).与其它氨基酸不同的是,色氨酸的芳香结构部分是由一个苯环和一个吲哚环连接而成的.苯环是疏水性的,吲哚环则具有一定的亲水性.吲哚环与两性离子头基扩展形成了一个较大的水结构破坏区域,结果使得同手性分子(L-L)在发生π-π堆叠作用时,可以采取更为合适的构型,疏水成分得到显著增强,因此表现出很大的吸热效应(KΔHm>0).而对于消旋体系(D-L),由于堆叠构型不合适(如采取edge-to-face的构型)疏水成分不强,分子的亲水部分在对分子作用过程中起决定作用,因此表现出较大的放热效应(KΔHm

表2中苯酚的KΔHm=816J·kg·mol-2,是一个较大正值,说明苯酚分子在水中具有较大的疏水能力,其对分子作用过程中疏水-疏水作用占优势,表现为吸热效应;与之相比,对羟基苯乙酸尽管在分子结构上增加了一个疏水性的—CH2—基,分子的

(a)edge-to-face(b)offset

[21]

(c)face-to-face

Fig.1

图1芳核π-π堆叠作用的几何构型

Geometricconfigurationsofaromaticπ-πstacking[21]

734

ActaPhys.-Chim.Sin.,2009

References

Vol.25

疏水性得到增强,但因为同时又多了一个亲水性较强的—COOH官能团,尤其—COOH的存在造成对分子作用过程中分子疏水区域并排重叠(juxtaposition)的严重空间阻碍,反而使得亲水-亲水作用占据了绝对优势,因此KΔHm是一个很大的负值(KΔHm=(-2032±134)J·kg·mol-2).而具有手性中心的D-对羟苯基甘氨酸,在分子结构上比对羟基苯乙酸多了一个亲水性的—NH2基团,按理应该具有更负的KΔHm,但实际是KΔHm=(-726±8)J·kg·mol-2.说明芳核外部的手性中心在起识别作用,使得π-π堆叠时环表面覆盖度增大,疏水成分得到增强,削弱了对分子作用过程的亲水-亲水效应.

对于表2中属芳杂环的吡啶及其甲基取代衍生物,Yu等[14]报道了它们的稀释焓,并从溶质-溶剂相互作用角度对甲基的位置异构取代产生的焓对作用作了初步探讨.如表2所示,这些化合物在水溶液中KΔHm值的递变如下:o-methylpyridine<pyridine<m-methylpyridine<p-methylpyridine,而且均为正值.说明在吡啶环上甲基的引入和甲基在环上的取代位置直接影响了π-π堆叠作用的几何构型,使得疏水成分发生不同程度的变化.邻位取代时吡啶环的疏水成分最小,对位取代时最大.UV光谱等研究也表明[26,27],吡啶及其衍生物在水溶液中存在自缔合现象,吡啶环上取代基的种类、数目和取代位置,以及分子不同的质子解离形态对自缔合作用有重要影响;在大多数情况下光谱效应表现为减色效应(hypochromiceffects),因此认为其自缔合模式是吡啶环的垂直π-π堆叠.在少数情况下,例如吡啶-2,6-二羧酸的单质子解离形态,则表现为增色效应(hyperchromiceffects),其自缔合模式是吡啶环之间通过氢键的共线连接.

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[胡新根,于

丽,林瑞森,方盈

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21Hunter,C.A.;Sanders,J.K.M.J.Am.Chem.Soc.,1990,112(14):

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22West,A.P.;Mecozzi,S.;Dougherty,D.A.J.Phys.Org.Chem.,

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23Cozzi,F.;Siegel,J.S.PureAppl.Chem.,1995,67(5):68324Palecz,B.J.Am.Chem.Soc.,2002,124(21):6003

25Castronuovo,G.;Elia,V.;Velleca,F.J.SolutionChem.,1995,24

(12):1209

26Peral,F.;Gallego,E.J.Mol.Struct.,1994,326:5927Peral,F.J.Mol.Struct.,1992,266:373

4结论

综上所述,微量热法是研究溶液中分子间非键相互作用的一种可靠方法,稀释焓可以用拟等步自堆叠作用的化学模型进行处理,模型参数KΔHm描述了对分子作用过程(PMI)中平衡和焓变的综合效应.所研究的四种芳香族氨基酸及其它芳香族化合物的π-π堆叠作用都可以看作是一种特殊的疏水-疏水作用,静电作用、取代基空间位阻、氢键和手性选择性作用等对疏水协同性都具有重要影响.

范文四:7-羟基香豆素与三种芳香族氨基酸作用的荧光光谱研究-论文 投稿:范撞撟

第3 3 卷 , 第8 期  2   0   1   3年 8月 

S p e c t r o s c o p y   a n d   S p e c t r a l   An a l y s i s  

析 

Vo 1 . 3 3 , No . 8 , p p 2 1 1 7 — 2 1 2 2   Au g u s t ,2 0 1 3  

7 一 羟 基 香 豆素 与 三 种 芳香 族 氨 基酸 作 用 的荧 光 光谱 研 究 

江  欢 , 朱燕舞 , 王  燕, 何建 波 

合肥工业 大学化学工程学 院,可控化学与材料化工安徽省重点实验室 , 安徽 合肥 2 3 0 0 0 9  

运用荧光光谱 和紫外 光谱研究 7 一 羟基香豆素 UB M 分别与色氨 酸 T r p ,酪氨酸 T y r 和苯丙氨 酸 P h e  

三种芳香族氨基酸 的相互 作用。 结果表 明在 模拟人 体生理 条件下 , U MB能引起 上述氨基 酸发生 荧光猝灭 ,  

最大猝灭波长依次为 3 4 7 ,3 0 3 和 2 8 2   n I n , 猝灭机 制均 为静态猝 灭 ,相互之 间均 以摩 尔 比 1: 1形成 了复合 

物, 且得到 两种温度 下 UMB与 Tr p , Ty r 和P h e 反应的表观平衡 常数 K  分别 为 2 9 8 . 1 5   K时 2 . 9 9 3 ×1 0   ,  

7 . 8 5 8 ×1 0  和 1 . 1 8 6 ×1 0 。 L・ mo l ~, 3 1 0 . 1 5   K时 2 . 7 0 2 ×1 0   ,1 . 0 6 3 ×1 0  和 8 . 3 5 2 ×1 0 。 L・ mo l ~ 。热 力 

学 函数 变化表 明 UMB与 以上 三种 氨基 酸结合 作用 较强 ,其 中 UMB - T r p相 互作用 力是 氢键或 范德 华力 ,   UM ̄Ty r 和 UMB - P h e 相互作用 主要 以疏水作用为 主,同时都可能存在偶极一 偶极之间 的相互作用 。   关键词  7 一 羟基香 豆素 ; 芳香族 氨基 酸 ; 荧光光谱 法 ; 紫外光谱法 

中图分类号 : 04 3 3 . 5   文 献 标 识 码 :A   D OI :1 0 . 3 9 6 4 / j . i s s n . 1 0 0 0 — 0 5 9 3 ( 2 0 1 3 ) 0 8 — 2 1 1 7 — 0 6  

合成激素和维持生命 的基本 物质 。研究这些氨基 酸 的药理 活 

引  言 

香豆 素是 一类 肉桂 酸 内酯 ,广泛分 布 于植 物 中,具 有优 

异的抗真菌 、抗溃疡 、 抗 凝血 、 利尿 、镇痛 、 催 眠等性能 ,被 

性 ,有助于深入了解药物在体 内的运输和代谢过程 。   中药小分子与生物分子 的相互作用一 直是 相关 交叉 领域 

的研究热点l 5   ] ,目前 对于 中药小 分子 与氨基 酸分 子的作 用  机制及药理活性鲜有 报道_ 8

 ] ,探讨 其相 互 间作 用机 理 ,对 

广泛应用于生 物、医药 、染料 、聚合物科 学等 领域_ 1 铷 。7 一 羟  基香豆素 ( 结构式如 图 1 ) ,即伞形 花 内酯 ,属 于香豆 素类 天  然化合物 ,是芸香料和伞形科 中草药 的主要有 效成 分 , 具 有 

抗炎作用 ,能够抑制肥大细胞脱颗粒  j 。  

CHC   H  

于 了解生命过程和研究药物作用 机制 有着 显著 的意义 。  

荧光光谱法广泛应用 于药物小分 子与生 物分子之 间相互  作用 的研究 。在生 理条 件下 , 它可 以对低浓度 的物质 进行测 

量, 并且灵敏 度高 、 选择 性好  ] 。本工作 运用荧 光光谱 和紫  外光谱研 究 中药小 分子 UMB分别 与 Tr p , Ty r和 P h e内源  荧光物质之 间的相互作用 ,探讨 了其 相互作用 机制 。一方 面  为 阐明 UMB在人体 内的储存方 式 、传输机 制及药 理作用 等 

Tr p

。 

UM B 

cH2 CHCo0H    cH2 CH    C  ∞  

提供重要信息 ;另一方面又为临床研究 、 药 物分子设 计等 提  供理论依据和重要方法 。  

1 实验部分 

1 . 1 仪 器 与试 剂 

F - 2 7 0 0型荧 光分 光 光度 计 ( Hi t a c h i 公 司,日本 ) ,Uv _  

氨基酸是一类 重要 的生物分子 , 在 生物体 内作 为蛋 白质  的基石和代谢 的中间体 发挥 着重 要作用  。色 氨酸 ,酪氨 酸  和苯丙氨酸 ( 结构式如 图 1 ) 均具有 内源荧光 , 是构成蛋 白质 、  

收稿 日期 : 2 0 1 2 — 1 2 - 1 8 。 修订 日期 :2 0 1 3 — 0 3 — 2 5  

Vi s - 2 5 0 0型紫外可见分 光光 度计 ( 日本 岛津 公 司) ,P HS - 3 E  

p H计 ( 上海雷磁精密科学仪器 有限公 司) , J K- 2 2 0 0 B型超声 

波清洗器 ,1 8 1 0 一 B型石英超 纯水蒸 馏器 , THZ - 8 2型数 显水 

基金项 目: 国家 自然科学基金项 目( 2 0 9 7 2 0 3 8 ) , 安徽省 自 然科学基金项 目( 1 2 0 8 0 8 5 Q B 2 9 ) , 可控化学与材料化工安徽 省重点实验室开放资金  项 目( 2 0 0 9 S J S Y 0 5 0 9 ) , 高等学校博士学科点专项科研基金项 目( 2 0 1 0 0 1 1 1 1 2 O 0 2 0 ) 资助 

作者 简介 : 江 欢 ,女 ,1 9 8 8 年生 ,合肥工业大学化工学院硕士研究生 

e - ma i l : y a n wu z h u @s i n a . c o m 

e - ma i l : j i a n g h u a n 4 0 5 @1 6 3 . c o n  r

*通

讯 联 系 人 

2 l 1 8  

浴恒 温振荡 器。  

光谱学与光谱分析 

溶液 , 测定其在 2 0 0  ̄5 0 0   n I n的 UV谱图 。  

第3 3 卷 

L _ 色氨酸 ,   酪氨酸 ,卜苯 丙氨酸 和三羟 甲基 氨基 甲烷 

( Tr i s 碱) 均为生 化级 ( B R) 试剂 , 盐酸 ,无水 乙醇和氯 化钠均 

为分析纯试剂 , 实验试剂均购于上海国药集 团化 学试 剂有 限  公司 ; 二次蒸馏水为实验室 自制 。  

1 . 2 方 法 

1 . 2 . 1 溶 液 配制 

2 结果与讨论 

7   6 

扫H ∞ 8昔_ |  

4   3  1 

∞ 砌   吣 ∞   ∞   ∞ 吣   砌 ∞   0   2 . 1  7 - 羟基香豆素与三种氨基酸的荧光猝 灭光谱  固定 Tr p浓 度 ,递 增 UMB浓度 ,激 发波 长 为 2 7 6   r i m 

时, 在 实 验 条 件 下 测 定 UMB - T r p的 荧 光 光 谱 。图 2为  2 9 8 . 1 5   K( a ) 和3 1 0 . 1 5   K( b ) 时 Tr p与不 同浓度 UMB相互 作  用 的荧光光谱 图。Tr p荧 光发 射波 长为 3 4 7   n m,而 4 5 3   n r n  

为 UMB的荧光发射峰 ,与氨基 酸相距较远 ,因此不予考虑 。   由图 2可见 ,随着 UMB浓度增加 ,UMB与 Tr p发生相互作 

将 UMB配 制 成 4 ×1 0 I 3   oo t l ・L   的 标 准溶 液 待 用 ;   Tr p ,T y r 和P h e 分别配制成浓度为 2 ×1 o 一,2 ×1 O - 3 和2 ×   1 0   mo l ・ L  的标准溶液 待用 ; 配制 0 . 0 2   oo t l ・L  的 p H 

7 . 4   T r i s — HC 1 缓 冲溶 液 ( 含0 . 1   oo t l ・ L   的 Na C 1 以维持 溶 

液恒定 的离子浓度 ) 。光谱 测定 时所需 各物质 的溶液 均用 缓 

冲溶液定容 。  

1 . 2 . 2 荧光 光谱 测 定 

用 导致 T r p 发生 荧光 猝灭 ,且 荧光 光谱 峰 峰形基 本 保持 不  变, 其位 置略有 红移 ,在 3 6 7   n m 附近有 一等发 射点 ,表 明 

UMB与 Tr p 形成 了复合物r 8 ] , 从而进一步确证 UI V I B与 T r p   之间存在相互作 用。  

分别在恒定温度 2 9 8 . 1 5 和 3 1 0 . 1 5   K条件 下 , 按 实验需 

要, 准确移取一定量的 UMB和氨基 酸标 准溶液 于 1 0   mL容  量瓶 , 用p H  7 . 4的 Tr   Hc l 缓冲溶液 定容 ,水浴恒温振 荡 

l   h , 然后冷却至室温 ,置于 1   c m 的石英 比色皿 中 , 设 置荧  光光谱仪 的激 发和发 射光栅

狭缝均 为 5   n m,光 电倍 增 管 电 

分别固定 Ty r 和P h e 的浓度 ,依次递增 UMB浓度 ,测 

定获得 2 9 8 . 1 5   Ki l n 图3 ( a ) ] 和3 1 (   . 1 5   K[ 如图 3 ( b ) ] 时 

UMB - Ty r 及 UM P h e 的荧光光谱 , 结 果显示 UMB对 Ty r   和P h e的作用 与 U MB - Tr p 作 用类 似 , 也发生荧光猝灭 。 Ty r   和P h e的激 发波长分别 为 2 7 3和 2 5 6   n m 时,Ty r 和 P h e的 

压为 7 0 0   V,扫描 速度为 3 0 0   n 1 2 2 ・mi n ~, 在此 条件 下记录 

2 8 0  ̄5 5 0   B i n范 围内的荧光光谱 。   1 . 2 . 3 紫外光谱测定  以p H  7 . 4的 T r i s — HC 1 缓 冲溶 液 ( 含 0 . 1   oo t l・L _ 1的  Na C 1 的) 配制 1 ×1 0   t oo l ・ L   的 UMB,T r p ,T y r 和P h e  

荧光发射波长分别为 3 0 3和 2 8 2   i l m; UMB - T y r 和 uM P h e  

的荧光峰形及峰位置基本保 持不 变 ,且在 3 5 1和 3 5 5   D _ I n附 

近均有一等发射点 , 表 明其相互之 间作用也 形成 了相应 的复 

合物  8 【 。  

Wa v e l e n g t h / n m 

Wa v e l e n g t h / n m 

Fi g . 2   Fl u o r e s c e nc e   q ue nc h i n g   s pe c t r a   o f   t he   i n t e r a c t i o n   be t we e n  UM B  a nd   Tr p 

( a ):2 9 8 .1 5   K ;( b) :3 1 0 . 1 5   K  a n d   l i ne a r   r e l a t i o ns h i p s   b e t we e n   Fo — F  a n d   c ;C T m一 3 ×1 0一。mo l・I   ,  

c  ̄ / l O 一  mo l ・ L  1   f r o m  0   t o   9 : 0 ,0 . 2 , 0 . 4 ,0 . 6 , 0 . 8 ,1 . 0 ,1 . 2 ,1 . 4 ,1 . 6 ,1 . 8  

0 0:b l a n k   s o l u t i o n,0 1:c   一 5× 1 0 一   mo 卜 L 

图 2和 图 3的插 图为 F 0 一F对 C U M B ( 2 ×1 0   ~2 . 4 × 

能有动态猝灭和静态猝灭 。 假设 7 一 羟基香豆素对三种氨基 酸 

发生 的是动态猝灭 ,其应 遵循 S t e r n - V o l me r 方程l g ]  

F o / F… 1   Ks v c   Kq Z

' 0 C   ( 1 )  

1 0  m o l ・ L _ 1 ) 的线性拟合 曲线 , 其中F 0 和 F分别表 示不 

存在和存在猝灭剂物质的荧光强度。由插 图可 知相应 回归系  数均在 0 . 9 9以上 , 呈现很好的线性相关性 , 表明该 法可用于 

UMB浓度的测定 。   2 . 2  7 - 羟基香豆素对三种氨基酸的荧光猝灭机理 

式中 , C 为猝灭剂浓度 ,Ks v 为 动态 S t e r n - Vo l me r 猝 灭 常数 ,   K  是 由扩散过程 控制 的双分 子动态猝 灭速 率常数 ,r 0为没  有猝 灭剂存在 下物 质的荧光分子平均 寿命 。  

根据式( 1 ) 绘 制三种 氨基 酸分 别在 2 9 8 . 1 5和 3 1 0 . 1 5   K   下的 ( F 0 / F 一1 ) ~c的线 性拟合 曲线 ( 如 图 4所示) 。 结 果显 

荧光猝灭是溶液 中猝灭体分子和荧光物质分子之间发生  相互作用 ,使荧光物质的荧 光量子效 率降低或激发态 寿命 缩  短, 从 而导致荧光强度降低 的现象 。 荧 光强度 降低 的原 因可 

示对于 Tr p和 P h e , 温度升高斜率 下降 ; 而T y r 则刚好相反 ,  

第8 期 

光谱 学与光谱 分析 

2 l l 9  

扫l s 蜀  I I —  

言  

重  

5   4  

1  

2 7 0  

3 0 0  

3 3 0  

3 6 0  

3 9 0  

3 0 0  

3 3 0  

3 6 0  

Wa v e l e n g t h / a m 

Wa v e l e n g t h / n m 

70 0 0  

6Oo 0  

5   0 0 0  

40 0 0  

5 0 0  

0  

2 7 0  

3 0 0  

3 3 0  

3 6 0  

3 9 0  

3 0 0  

3 3 0  

3 6 0  

Wa v e l e n g t h / n m 

W a v e l e n g t h / n m 

Fi g .3   Fl u or e s c e nc e   que nc hi n g   s p e c t r a s   oft h ei nt e r ac t i o ns   o f UM B  wj t h  

a nd Ph e  

( a ) :2 9 8 . 1 5   K;( b) :3 1 0 . 1 5   K  a n d   l i n e a r   r e l a t i o n s h i p s   b e t we e n( F0 一 F) a n d   c ;  

c T w = = 5 ×1 0 —  mo 1 ・ L 一1 , C p h e : =4 ×1 0 —  1 1 1 0 l ・L   ,c  ̄ / l O 一  mo 1 ・L 一  Fr o m  0   t o   1 2 :  

0,0. 2 ,0 . 4,0 . 6,0 .8 ,1 . 0,1 . 2,1 . 4,1 . 6

,1 . 8 ,2 . 0,2 . 2 ,2 . 4 .( o o:b l a nk   s o l u t i o n )  

O . 2 4   0 . 1 8  

毒 0 . 1 2  

O . O 6  

0  

0  

4  

8  

1 2  

l 6  

2 O  

0  

4  

8  

l 2  

l 6  

2 O  

O  

5  

l O  

1 5  

2 0  

2 5  

l 0 6 c   mo 1 .  

1 0 6 c   mo l - L 

l 0 6 c   mo 1 . L’  

ig F . 4  T h e   F o   7 F 一1   a g a i n s t   1 0 % p l o t s   o f   t h e   i n t e r a c t i o n s   o f   U MB   wi t h   t h r e e   a mi n o   a c i d s   a t   2 9 8 . 1 5   a n d   3 1 0 . 1 5   K 

( a ) : c T r p 一3 ×1 0 一 。 mo l ・L 一  ;( b ) :C T  一 5 ×1 0 一  mo l ・ L一   ;( c ) :c P l 1 e 一4 X1 0 一  mo l ・L 一   ;c u M B 一( O . 2 ~2 . 4 ) / 1 0 一  mo l ・ L  

随着温度 的升 高斜 率增 加 , 据 此推断 UMB对 Tr p和 P h e的  荧光猝灭作用为静态猝灭 , 而对 Ty r 的猝灭为 动态猝灭 L 1  。   根 据 Tr p ,T y r 和P h e的荧 光 寿命 分 别 为 3 . 1×1 0 ~,   3 . 6 ×1 0 - 9 和6 . 8 ×1 0  s 『 1  , 计 算获得 Ks v , K 以及各相 关  线性 回归系数  ,列于表 l ,表 明 UMB与三种氨基 酸的线 

猝灭 。  

为进一步验证 UMB - Ty r 荧 光猝 灭机 理 ,测定 了 UMB,  

T r p ,T y r 和P h e 及 其相互作 用的紫外 吸收光谱 。UMB ,T y r   及其相互作用的紫外 吸收光谱 图如 图 5所示 :UMB和 Ty r  

的最大吸收波长 分别为 2 0 8和 2 2 3   n l T l ,UMB - Ty r 两处 的最 

性拟合程 度很高 , 且K   值 均在 1 O  数量 级 以上 , 大 于各种 

猝 灭 体 对 生 物 大 分 子 的 最 大 扩 散 猝 灭 常 数 2× 1 0  L・  

oo t l   ・S ~ ,由此推断 UMB与三种 氨基 酸均形成 了基 态复  合物 , 其猝灭机理 为静 态猝 灭_ 】  , 而 由温度对荧光猝 灭的影 

大吸收波长分别为 2 0 5和 2 2 0   a m,较 UMB和 T y r 均 蓝移 3  

m , 从 而说明 Ty r 与 UMB之间作 用形成 了基 态复合物 ,其  荧光猝灭类 型应属 于静 态猝灭 。UMB - T r

p的最 大 吸收波 长  为2 0 3和 2 1 8   n l n ,较 UMB和 Tr p分 别红 移 1   n l T l ,蓝移 1   n m;UMB - P h e 的最 大吸 收波 长 为 2 0 6和 2 0 9   a m,较 UMB  

响得到 UMB - T y r 的猝 灭机 理 为动态 猝灭 ,产 生矛盾 , 叉 实  验采用 0 . 1   oo t l ・ L  Na C I 控 制溶 液离子强度 ,Kq的增 大可  能是 离子强度影 响的结 果r 1  ,二 者之 间 的作用 可 能为 动态 

和P h e 分别蓝移 2   n l n , 红移 2   n l T l ; 从而也进一步说明 UMB -  

Tr p和 UMB - P h e的荧光猝灭机理是静态猝灭 。  

2 1 2 O  

光谱学 与光谱分析 

第3 3 卷 

Ta b l e   1   S t e m- Vo l me r   q u e n c h i n g   c o n s t a n t s   o f   t h e   i n t e r a c t i o n   o f   UM B   wi t h   t h r e e   a mi n o   a c i d s   a t   d i f f e r e n t   t e mp e at r u r e s  

譬【 B   J 0 ∞ 0 《 

0 如  5  O  5  O  5  o D  

2 . 3  7 - 羟基香豆素与三种氨基酸的表观结合常数 K 与结合  位 点数 n  

小分子与分子结合 的表 观结合 常数 K 和结合 位点数  可 由式 ( 2 ) 求 出l 】   l  ( F o —F) / F ]一 l g K  +n l g c   的l g [ ( F o -F) / F] 1 g c 的双对数图 , 如 图 6所示 。   由图 6 线 性 拟合 的截 距 和斜率 ,分 别 获得 两温 度下 的 

2 0 0   2 2 0   2 4 0   Wa v e l e n g t h / n m  2 6 0  

( 2 )  

分别作 2 9 8 . 1 5和 3 1 0 . 1 5   K下 UMB与 三种 氨基 酸作用 

K   ,   和线性 回归系数 R   z , 结果见表 2 。  

Ta bl e   2   T h e   b i nd i n g  c o ns t ant s  o f   t h e   i n t e r a c t i o ns   0 f啪 wi t h   t hr e e   a mi no   a c i s  d

Fi g. 5   Ab s o r p t i o n   s p e c t r a s   o fTy r   a nd UM B  a n d 

t h ei n t e ac r t i o n   b e t we e n UM B a n dTy r  

l:UM B(1× 1 0 一   mo l・ I   一  ); 2 : Ty r ( 1X 1 0 一  mo l・L一

 ); 3:   U M B- Ty r ( Mo l a r   r a t i o   1 :1 ) :p H  7 . 4   Tr i s - HC1   b u f f e r   s o l u t i o n   wa s  

u s e d   a s   b l a n k   s o l u s i o n  

各方程的线性 回归系数 均在 0 . 9 9以上 , 线 性相 关性很 

好, 据表 2 可得 出以下结论 :( 1 ) UMB与三种芳香族 氨基酸 

的  接近 1: 1 , 表 明其相互 间分子 体积 接近 ,一分子 UMB   基本是与一分子氨基酸结合 ;( 2 ) 相应 的结合平衡 常数 K   值 

均在 1 O 。以上 ,表明 UMB与 Tr p , T y r 和P h e 之间有较 强的  结合作用 ,又考虑三种氨基 酸分别与 UMB发生荧 光猝灭 的 

浓度大小 , 可知其相互作用 的选择性 : uM T r p >uM Ty r  

2 ・ 1  

>UMB - P h e ;( 3 ) 温度对 UMB与三 种氨基 酸 的结合 也有 一  定 的影响 。  

2 . 4  7 - 羟 基 香 豆 素 与 三 种 氨 基 酸 相 互作 用 力 类型 的确 定  

1 . 4  

由于 △r H 随 温度 变 化很 小 ,故 将 △   H 近似 看 为 常 

。 一 7  

霎 。  

数 ,由式( 3 ) 一式 ( 5 ) 计算 UMB与三种 氨基酸结 合的热力 学  参数 △ r H  , △r G 和 △r S m , 结果列于表 3 。  

△  G  一 一 RT1 n K  ( 3 )  

。 ・ 7  

- n 嚣一 垒  ( 击 一 去 )  

㈤  

( 5 )  

1 . 4   5 . 7   — 5 . 4   — 5 . 1   l g c   — 4 . 8  

△ r 5   一   宁 

l  ̄ i g . 6  T h e l g E ( F o -F ) / F ]a g a i st n l g ep l o t s   o f t h e i n t e r a c t i o n s  

O fUM  wi t ht h r e e   a n l i n o   a c i s  d ( a ) :2 9 8 . 1 5   K;( b ) :3 1 0 . 1 5   K; c T r p 一2 X1 0 一   mo l ・L 一   ,   一5 X 

基于 UMB与三种氨 基酸的结合 常数 K  及各 热力学 参  数 ,由表 3可看出 :( 1 ) UMB - Tr p反应过程 中 △ r Hm <O ,表  明为放热反应 ,升高温度 不利 于其生 成复合 物的方 向进行 ,   结合常数减少 ,即生 成复合物稳定 性下 降 ;( 2 ) UMB - Ty r 和  UMB— P h e 结 合 过程 的△   Hm >O, 表 明为 吸热 反 应 , 升 高温 

1 0 —  t oo l ・L 一   ,c

P h e :4 ×1 0   mo l ・L  1 ,C U M B一 (0 . 2 ~2 . 4 ) /  

l O -S   mo 1・L  1  

第8 期 

光谱学与光谱分析 

2 1 2 1  

T a b l e   3   T h e r mo d y n a mi c   p a r a me t e r s   o f   t h e   b i n d i n g  

o f U M Bw i t h t h r e e   a m i n o   a c i d s  

3 结

论 

应用荧光和紫外光谱在人 体生理 p H 值下研究 UMB分  别与 T r p , Ty r 和P h e的相互作用 。 荧光光谱显示 UMB与三 

种氨基酸相互之间均发 生 显著 的静 态荧 光猝灭 ,均 以 1:1   紧密结合 ,并获得三种 体系分别 在两种温度 下反应 的 K  和 

。 

紫外 光谱 显 示 UMB - Tr p 、UMB- T y r 和 UM P h e 较 作 

用前 均产生一定的红移和蓝移 , 进一 步说 明 UMB与三 种芳 

度 有利于 向着生成复合物 的方向进行 , 结 合常数 增大 ,生成 

复合物稳 定性增 强 ;( 3 ) UMB与三种 氨基酸 结合 的 △ r G m <  0 ,表明结合过程均是一个 自发分子作用 过程 ;( 4 ) 根 据药物 

香族 氨基 酸之间的结合作用较强 ,形成 了相应 的复合物 ,从 

而也 验证 了以上三 种作 用体 系 的荧 光猝灭 机理 均 为静态猝 

灭。  

分 子与生物大分子作用 的有关 热力学参数可 以简单判定其相 

互 作用类型L 1  , 在 UMB - T r p作用过 程 中 , △ r G  d0 , A   H 

结合 荧光和紫外光谱数据 ,获得结合过程 的 Gi b b s函数  值, 说 明 UMB与 三种 氨基 酸 的作 用 过程 是 自发 的 ,其 中 

UMB - Tr p作用主要是氢键 或范德 华力 ,UMB - T y r 和 UM 

< 0 , A   S m d0 , 表 明其 间作 用力 可 能主 要是 氢键 或 范德华 

力; UMB - T y r 和 UMB - P h e 结合过 程 中, △   G m d0 , △   H  > 

P h e 作用主要 以疏 水作 用为 主 , 又 UMB中含有 7 一 羟基 ,使 

其具 有分 子极 性 , 推测 UMB与三种芳香 族氨基 酸之 间还存  在偶极一 偶极 之间的相互作用 。  

0 , △   S m >o , 表明它们之 间的作用 力可能 主要 以疏 水作用 为 

主; 又 由于 UMB中含 7 一 羟基 ,故其 与氨基 酸 的结合 还包含  偶 极与偶极之间 的静 电作用力 。  

I   X i a n - g u o , Z E N G   Mi n g , D E N G   L i e , e t   a l ( 韦献果

, 曾   明, 邓 [1 ]   WE

烈, 等) .F o o d   S c i e n c e ( 食品科学) , 2 0 1 2 , 3 3 ( 1 3 ) : 3 4 3 .   l l u t i   F,Fo n t a n a   G ,Bo   L  D,e t   a 1 .Bi o o r g a n i c& M e d i c i n a l   Ch e mi s t r y,2 0 1 0,1 8( 1 0) :3 5 4 3 .   [2]   Be

o b i n i   J ,Mi s h r a   A,S a n d h y a   K,e t   a L   S p e c t r o c h i mi c a   Ac t a   P a r t   A:Mo l e c u l a r   a n d   B i o mo l e c u l a r   S p e c t r o s c o p y ,2 0 0 1 ,5 7 ( 5 ) :1 1 3 3 .   [ 3 ]   Sh

y a ma   D  O ,M a r a n g o n i   S,Di z - Fi l h o   E  B  S,e t   a 1 . Tox i c o n,2 0 0 9,5 3( 4) :4 1 7 .   [ 4 ]   To

n g e r f o r d   G,R y d e r r o r s   L,F e r n a n d e s   M  J   G, e t   a 1 .J o u r n a l   o f   P h o t o c h e mi s t r y   a n d   P h o t o b i o l o g y   A: C h e mi s t r y ,2 0 1 0 , 2 1 5 ( 2 — 3 ) :2 1 4 .   [5]   Hu

  I U Ge n - l a n ,NI Yo n g - n i a n ( 刘根兰 ,倪永 年) .Ch e mi c a l   J o u r n a l   o f Ch i n e s eUn i v e r s i t i e s ( 高等学校化学学报 ) ,2 0 0 8 ,2 9 ( 7 ) :1 3 3 9 .   [ 6 ]  I

t e i   I ,Hi l l e b r a n d   M.J o u r n a l   o f   P h a r ma c e u t i c a l   a n d   B i o me d i c a l   An a l y s i s ,2 0 1 0 , 5 1 ( 3 ) :7 6 8 .   [7]   Ma   I U  Xu e - f e n g ,XI A   Yo n g - me i ,F ANG - Yu n   e t   a l ( 刘雪锋 ,夏咏梅 , 方 云, 等) .Ac t a   C h i mi c a   S i n i c a ( 化学学报) , 2 0 0 4 ,6 2 ( 1 6 ) :1 4 8 4 .   [ 8 ]  I

  X,I . u   S,Ya n g   Y ,e t   a 1 . Sp e c t r o c h

i mi c a   Ac t a   Pa r t   A :M o l e c u l a r   a n d   Bi o mo l e c u l a r   S p e c t r o s c o p y,2 0 1 2 ,91 :1 1 3 .   [ 9 ]   Yu GAN  X i a o - j u a n, LI U  S h a o - p u ,I J U  Z h o n g - f a n g ,e t   a l ( 甘晓娟 ,刘绍璞 ,刘忠芳 ,等 ) .Ac t a   Ch i mi c a   S i n i c a ( 化学学报 ) ,2 0 1 2 ,7 0 ( 1 ) :   E l O 3  

5 8 .  

Qi a n - y i n g , L I U  Z h o n g - f a n g ,HU  Xi a o - l i , e t   a l ( 许倩影 , 刘忠芳 , 胡小莉 , 等) .C h e mi c a l   J o u r n a l   o f   C h i n e s e   Un i v e r s i t i e s ( 高等学校化  [ 1 1 ]   XU 

学学报 ) ,2 0 1 1 ,3 2 ( 7 ) :1 4 9 2 .  

U   S i — m i n g , P E N GY u n - p i n g , Y U   S h u - j u a n , e t   a l ( 俞思 明, 彭运平 , 于淑娟 , 等) . S p e c t r o s c o p y   a n d   S p e c t r a l A n a l y s i s ( 光谱学与光谱分  E 1 2 3  Y

析) ,2 0 1 2 ,3 2 ( 8 ) : 2 1 6 6 .  

H A N GY o n g - h u i , I   I Hu a , S U N   J i a - j u a n , e t   a l ( 尚永辉 , 李 华, 孙家娟 , 等) . J o u r n a l   o f A n a l y t i c a l   S c i e n c e ( 分析科学学报) , 2 0 1 0 , 2 6   [ 1 3 3  S

( 1 ) :6 7 .  

a r i d b o d   F, Ga n j a l i   M  R,I . a r i j a n i   B,e t   a 1 .S p e c t r o c h i mi c a   Ac t a   P a r t   A: Mo l e c u l a r   a n d   B i o mo l e c u l a r   S p e c t r o s c o p y , 2 0 1 1 ,7 8 ( 1 ) :9 6 .   E 1 4 3  F

2 1 2 2  

光谱 学与光谱 分析 

第3 3 卷 

S t u d y   o f   I n t e r a c t i o n   o f   Um b e l l i f e r o n e   wi t h   Thr e e   Ar o ma t i c   Am i n o   Ac i d s  

b y   Fl u o r

e s c e n c e   S pe c t r o s c o py  

J I AN G  Hu a n , Z HU  Y a n - wu  , WANG   Ya n ,HE   J i a n - b o   An h u i   Ke y   L a b o r a t o r y   o f   C o n t r o l l a b l e   C h e mi s t r y   R e a c t i o n& Ma t e r i a l   C h e mi c a l   E n g i n e e r i n g ,S c h o o l   o f   C h e mi c a l   E n g i n e e r i n g ,  

He f e i   Un i v e r s i t y   o f   Te c h n o l o g y ,He f e i  2 3 0 0 0 9,Ch i n a  

Ab s t r a c t   Th e   i n t e r a c t i o n   b e t we e n   u mb e l l i f e r o n e( UMB) wi t h   t r y p t o p h a n( Tr p ),t y r o s i n e( Ty r )a n d   p h e n y l a l a n i n e( P h e ) wa s  

s t u d i e d   b y   u s i n g   f l u o r e s c e n c e( F S)a n d   u l t r a v i o l e t( UV)s p e c t r o s c o p y .Th e   r e s u l t s   s i l O W  t h a t   UM B   c a n   s t r o n g l y   q u e n c h   t h e   f l u —   o r e s c e n c e   o f   t h e   t h r e e   a r o ma t i c   a mi n o   a c i d s   wi t h   t h e   ma x i mu m  q u e n c h i n g   wa v e l e gt n h s   a t   3 4 7,3 0 3   a n d   2 8 2   n l T l ,r e s p e c t i v e l y .Da —   t a   a n a l y s e s   b a s e d   o n   t h e   S t e r n - Vo l me r   c u r v e   a n d   t h e   UV  s p e c t r o s c o p y   s h o w  t h a t   s t a t i c   q u e n c h i n g   o c c u r r e d   t h r o u g h   t h e   f o r ma t i o n   o f   t h e   c o mp l e x e s   o f   UM B  wi h  t e a c h   a r o ma t i c   a mi n o   a c i d   i n  

a   mo l a r   r a t i o   o f   1:1 .Th e   b i n d i g  n c o n s t a n t   K o f   UMB   wi t h   Tr p,   Ty r   a n d   P h e   i S   2 . 9 9 3 ×1 0  ,7 . 8 5 8 ×1 0  a d  n 1 . 1 8 6 ×1 0 0   L ・mo l 一  ( 2 9 8 . 1 5   K)a d  n 2 . 7 0 2 ×1 0   ,1 . 0 6 3× 1 0  a d  n 8 . 3 5 2 ×1 0 0  

L ・mo l ~( 3 1 0 . 1 5   K) ,r e s p e c t i v e l y . Th e   t h e r mo d y n a mi c   p a r a me t e r s   i n d i c a t e   t h a t   UM B  h a s   a   s t r o n g   i n t e r a c t i o n   wi t h   t h e   t h r e e  

a r o ma t i c   a mi n o   a c i d s .Hy d r o g e n   b 0 n d   a d  n V a n   d e r   Wa a 1 s   f o r c e   ma y   p l a y   a   ma j o r   r o l e   i n   t h e   r e a c t i o n   o f   UMB   wi t h   T r p , wh e r e a s  

h y d r o p h o b i c   i n t e r a c t i o n   s h o u l d   b e   r e s p o n s i b l e   f o r   t h e   b i n d i n g   o f   U MB  wi t h   Ty r   a n d   P h e .I n   a d d i t i o n,t h e   d i ol p e - d i p o l e   i n t e r a e —   t i o n   ma y   b e   a n o t h e r   f a c t o r   i n   t h e   r e a c t i o n s   b e t we e n   UM B   a d  n t h e   t h r e e   a r o ma t i c   a mi n o   a c i d s .  

Ke y wo r d s   Umb e l l i f e r o n e ;Ar o ma t i c   a mi n o   a c i d;Fl u o r e s c e n c e   s p e c t r o s c o p y ;U l t r a - v i o l e t   s p e c t r o s c o p y  

( Re c e i v e d   De c .1 8 ,2 0 1 2;a c c e p t e d   Ma r .2 5,2 0 1 3 )  

*C o r r e s p o n d i n g   a u

t h o r  

范文五:3种芳香族氨基酸的液相色谱分析及用于胸腔积液病因鉴别诊断 投稿:余懏懐

  摘 要:建立了一种同时测定人体胸腔积液中酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)的液相色谱分析方法,并将其应用于胸腔积液病因鉴别诊断。优化的液相色谱条件如下: Vertex TM AQ-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-10 mmol/L醋酸铵缓冲溶液(醋酸调至pH 5.6)为流动相进行梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长为210和278 nm。结果表明,3种氨基酸在各自相应的线性范围内线性相关系数均大于0.999; 信噪比为3时,检出限(LOD)分别为0.50, 0.17和0.20 μmol/L。胸腔积液样品经甲醇去除蛋白质后取上清液直接测定,3种氨基酸平均回收率在80.7%~101.1%之间,相对标准偏差为2.5%~8.7%。利用本方法对72例良恶性胸腔积液中的3种氨基酸进行分析,发现Tyr, Phe和Trp含量在不同疾病的样品中存在统计学差异,对胸腔积液病因鉴别诊断有一定的临床价值。   关键词:高效液相色谱; 氨基酸; 胸腔积液; 鉴别诊断   1 引 言   肺癌的发病率和死亡率在我国和全球都位列第一。目前肺癌的发现和诊断主要依靠影像学检查和组织病理活检,但存在一定漏诊和误诊,组织活检具有创伤性。原有的肺癌标志物如癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白片段19(CK19)、神经烯醇酶(NSE)、鳞状细胞癌相关抗原(SCC)等[1,2], 其特异及敏感性欠佳。因此开发新的、敏感性更高、特异性更强的潜在标志物对于肺癌的早期发现、病理分型、药物干预治疗等方面具有重要的指导意义。   芳香族氨基酸是指含有芳香环的氨基酸,如酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp),其代谢状态对人体具有重要的生理和病理意义。Neurauter等[3]利用高效液相色谱对卵巢癌患者的血浆进行分析,发现苯丙氨酸浓度显著高于正常人。Cascino等[4]研究发现血浆中游离氨基酸对不同肿瘤疾病具有不同的影响,肺癌患者较正常人的血浆中苏氨酸、丝氨酸和甘氨酸含量明显下降,色氨酸和谷氨酸明显升高,而乳腺癌患者中鸟氨酸、谷氨酸和色氨酸有明显增加。Deng等[5]应用HPLC/MS技术对胃恶性肿瘤病人和正常人胃液进行了对比分析,发现胃恶性肿瘤胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸含量明显高于正常人。研究表明,在恶性肿瘤患者和正常人血清、胃液等体液中,Tyr, Phe和Trp的芳香族氨基酸有明显区别,可以作为一种潜在的诊断标记物来筛选疾病。   目前,肺癌标记物主要研究对象集中在血清[6,7]、尿液[8,9]等体液以及各种组织[10,11]。胸腔积液是肺部疾病最为特异的人体体液,是肺癌或其他肺部疾病(如肺炎、结核性胸膜炎等)的常见并发症,是验证疾病病因、判断其良恶性的重要媒介之一[12]。目前对于良恶性胸腔积液的病因鉴别诊断研究主要集中在蛋白质组学[13,14],而对于其中氨基酸类的小分子代谢物研究未见报道。胸腔积液中含有大量亲水性物质,常规的反相和正相液相色谱未能将氨基酸和样品中复杂基质实现有效分离,而利用亲水作用机理来分析生物样品得到极大关注。本研究建立了基于极性基团改性的C18柱的HPLC方法,对恶性胸腔积液(肺癌患者产生)和良性胸腔积液(肺部感染疾病产生)中Tyr、Phe和Trp进行检测,并应用统计学方法探讨其对肺癌辅助诊断及确定临床病理分型的意义。   3 结果与讨论   3.1 蛋白沉淀剂的选择   在实验中,采用甲醇和乙腈两种常用的有机蛋白沉淀剂做了对比分析。对于同一份胸腔积液样分别用这两种溶剂进行沉淀蛋白,其余处理方法都相同。结果表明,经过高效液相色谱分析,甲醇除蛋白后得到的色谱图上具有更多的峰和更高的峰强度。   3.2 色谱条件的优化   对3种目标化合物Tyr、Phe和Trp进行全波长扫描,最大吸收波长分别为275, 210和278 nm,故采用278 nm对Tyr和Trp定量分析,采用210 nm对Phe定量分析。通过比较流动相中缓冲溶液的不同浓度(5, 10, 20和50 mmol/L)以及不同pH 值(4.6, 5.6, 6.6和7.6),确定乙腈-10 mmol/L醋酸铵缓冲溶液(pH 5.6)作为流动相。梯度洗脱程序如2.2节所述,一个样品的分析在40 min内可完成。   比较了Waters sunfire C18柱和Vertex TM AQ-C18柱对样品中Tyr、Phe和Trp的分离效果,AQ-C18柱的流动相为上述优化条件,而Waters sunfire C18柱的流动相条件如下: 流动相A为甲醇,流动相B为10 mmol/L醋酸铵缓冲溶液; 梯度洗脱程序: 0~5 min,10% A; 5~20 min,10%~30% A; 20~35 min,30%~60% A; 35~36 min,60%~10% A; 36~40 min,10% A。图1中a和b分别是采用Waters sunfire C18柱在210和278 nm检测波长下分离得到的色谱图; c和d分别是采用Vertex TM AQ-C18柱在210和278 nm检测波长下分离得到的色谱图。由图1可见,使用Waters sunfire C18柱时,酪氨酸不能得到有效分离,而AQ-C18色谱柱能使样品中3种氨基酸均得到有效分离。这是因为使用Waters sunfire C18柱时,流动相中水的比例一般不能超过90%,这不利于酪氨酸与胸腔积液中大量亲水性物质的分离。而AQ-C18色谱柱是一种极性基团改性的C18柱,能与100%的水流动相兼容,对于亲水性与极性化合物具有更强的保留能力和选择性,因而使样品中3种氨基酸既可有效分离,又各有合适的保留时间,且未受到其它色谱峰的干扰。因此,本实验采用Vertex TM AQ-C18色谱柱分析胸腔积液中的3种氨基酸。   3.4 良恶性胸腔积液中Tyr、Phe和Trp含量差别   采用本方法对72例肺癌和肺部良性疾病患者胸腔积液进行了分析(图2)。图2中a~f分别为210和278 nm检测波长下得到的3种氨基酸标准溶液、恶性及良性胸腔积液的色谱图。图中1、2和3所指色谱峰分别为酪氨酸,苯丙氨酸和色氨酸,其保留时间分别为6.24, 9.23和12.09 min,3种芳香族氨基酸均得到了有效分离。根据外标法计算得到沉淀蛋白后每个样品中3种物质的含量(原实际样品含量为该值的4倍,浓度分布范围见表4),分别对肺癌组与肺部感染疾病组,肺癌组与结核性胸膜炎组,肺癌组与肺炎组以及结核性胸膜炎与肺炎组3种氨基酸含量采用独立样本t检验进行统计学分析,结果见表4。

范文六:C18柱串联冠醚手性柱高效分离3种芳香族氨基酸对映体 投稿:侯諱諲

  摘要将C18柱与手性冠醚柱串联,建立了一种反相高效液相色谱法用于3种芳香族氨基酸对映体同时拆分的方法。考察了反相色谱流动相的组成、pH值、柱温、流速对对映体拆分的影响。实验结果表明, 当流动相为HClO4乙腈溶液(86∶14, V/V, pH 2.0)、柱温20℃、流速0.4 mL/min时,3种氨基酸对映体可获得基线分离。进一步对比了C18柱、冠醚手性柱和串联顺序不同的4种分离模式,结果表明,C18柱不能拆分氨基酸对映体,仅能分离不同种类氨基酸; 冠醚手性柱可分离氨基酸映体,但不同种类氨基酸色谱峰出现重叠; 串联模式能实现3种氨基酸对映体的基线分离,实现双柱优势互补,而串联顺序对分离影响不大,仅影响色谱峰的峰形。   关键词手性分离; 芳香族氨基酸; 对映体; 冠醚柱   1引言   手性是自然界的基本属性,手性分子对映异构体因其结构的差异而具有不同的光学性能和生物活性[1~3]。氨基酸是蛋白质最基本的组成单元,大多数的氨基酸都存在手性中心,故在临床诊断和食品分析等领域均涉及氨基酸的手性分离与分析[4,5]。常见的α氨基酸大多是L构型,是人体重要的营养物质; 而如阿尔茨海默症等某些重要的生理疾病则与D构型的氨基酸的浓度变化息息相关[6]。芳香族氨基酸是指含有芳香环的氨基酸,包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等[7]。在蛋白质化学和临床诊断与研究中,对芳香族氨基酸定量分析有着重要意义[8]。   手性化合物的拆分通常以正相色谱居多,可以获得较好的分离效果。然而,反相手性色谱具有毒性小、成本低的优点,并与实际样品具有更好的相容性。近年来,反相手性色谱固定相和反相手性色谱拆分都得到了快速发展[9],出现了一些适用于含水样品中外消旋体分离的反相色谱分析方法[10~12]。然而,单一色谱柱常不能有效解决复杂样品的手性分离分析问题, 色谱柱串联技术的提出,使这一问题得到一定程度的解决[13]。   C18柱与手性柱进行串联,可同时发挥两类色谱柱的作用,有助于进一步提升色谱分离效能。目前,已有C18柱串联手性柱拆分外消旋体的报道。Sardella[14]等利用C18柱与奎宁手性柱串联,同时拆分了甲状腺素和三碘甲状腺氨酸对映体。Perera等[15]将C18柱分别与3种手性柱串联,对16种手性药物进行了拆分,手性化合物之间得到了较好分离,结果也表明手性柱和流动相的选择是影响串联分离的重要因素。目前还未见此串联技术用于手性氨基酸的分离。氨基酸的分离常需使用专用的氨基酸柱,对色谱分离条件有特定的要求,有时还需要柱前衍生[16]或使用手性添加剂[17]。本研究以3种芳香族氨基酸(结构如图1所示)外消旋体为拆分对象,建立了C18柱串联手性冠醚柱同时拆分多种氨基酸对映体的反相色谱方法,实现了多种氨基酸对映体的高效分离,也为多种手性化合物的同时分离提供了新思路。   2实验部分   2.1仪器与试剂   Dionex Ultimate 3000 高效液相色谱仪(美国戴安公司),配备DAD检测器、自动进样器; Innoval ASB C18色谱柱(50 mm × 4.6 mm, 5 μm,天津博纳艾杰尔科技有限公司); CROWNPAK CRI(+)(150 mm × 3.0 mm, 5 μm,大赛璐药物手性技术上海有限公司); PS20洁康超声波清洗机(东莞洁康超声波设备有限公司)。   苯丙氨酸(99%)、乙腈(北京百灵威科技有限公司); 色氨酸(99%,阿拉丁试剂上海有限公司); 酪氨酸(98%,�_恩化学技术上海有限公司); HClO4(分析纯,天津市鑫源化工有限公司); 实验用水为纯净水。   2.2实验方法   准确称取适量的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸外消旋体标准品,以流动相为溶剂,配制成50 mg/L的3种氨基酸混合标准溶液。将C18柱与CRI(+)柱串联,C18柱在前、手性冠醚柱在后,通过高效液相色谱进行手性拆分。流动相为HClO4乙腈溶液(pH 2.0),检测波长为200 nm,进样量为20 μL,拆分中分别对流动相的配比、pH值、流速和柱温进行优化,其中t1和t2分别为氨基酸两个对映体的保留时间, Rs为分离度。   3结果与讨论   3.1流动相比例对拆分的影响   流动相的种类对手性分离的影响最为重要。冠醚柱CROWNPAK CRI(+)在HClO4溶液和乙腈组成的流动相中对手性氨基酸具有较好的分离效果,并结合文献所采用的流动相[18,19],以HClO4乙腈溶液(pH 1.5)为基础,通过改变流动相的比例,研究3种氨基酸混合物在串联柱上的手性分离效果,C18柱在前,手性冠醚柱CRI(+)在后,结果如表1所示。在所选条件下,3种氨基酸对映体均得到基线分离,酪氨酸最先被洗脱出来,色氨酸则保留时间最长; 随着流动相中乙腈比例的增多,对映体在两根色谱柱上的保留时间减少,分离度降低。兼顾3种氨基酸同时分离的分离度和分析效率,选择HClO4乙腈溶液(86∶14, V/V, pH 2.0)。   3.2HClO4溶液pH值对拆分的影响   流动相中pH值会影响分析物的存在形态,进而影响对映体在串联柱上的保留行为。分别调节HClO4溶液的pH值为1.5、2.0、2.5,HClO4溶液与乙腈的体积比为86∶14, 3种氨基酸对映体在3种不同pH值下的分离结果如图2所示。在使用pH 1.5和2.0的HClO4溶液为流动相时,所有的氨基酸对映体得到基线分离; 而HClO4溶液的pH 2.5时,3种氨基酸对映体出峰时间早且分离效果差,酪氨酸和苯丙氨酸两对对映体的4个色谱峰重叠在一起,在C18柱和手性柱上均没有被分离。结果表明:降低pH值可以得到更大程度的分离,氨基酸上的氨基在HClO4溶液中会被质子化,同时氨基酸的NH+4在手性联萘冠醚空腔内的作用增强,使得分析物在色谱柱上的保留时间增加。 进一步降低pH值时,各色谱峰的分离度增大,但出峰时间太长,综合考虑,选择流动相pH=2.0进行分离。   3.3柱温对拆分的影响   进一步考察串联柱的柱温对氨基酸对映体拆分的影响。结果如表2所示, 随着柱温的降低, 3种氨基酸对映体之间能获得更好的分离度,但在低温下,D酪氨酸和L苯丙氨酸的色谱峰逐渐重叠在一起,不利于3组氨基酸对映体的同时分离。因此,选择20℃为最优分离温度。   3.4流速对拆分的影响   适当增加流速可以缩短各对映体的出峰时间,提高效率; 但流速过高,使得分析物与固定相的作用不够充分,且不同手性化合物之间的色谱峰更加接近,分离效率降低。不同流速对3对氨基酸对映体在串联柱上的拆分情况的影响如表3所示。随流速增加分离度降低,但保留时间缩短,兼顾分离度和分析效率,选择流速为0.4 mL/min。   3.5串联模式对拆分的影响   C18柱串联冠醚手性柱分离3种氨基酸外消旋体,分离效果同时受C18柱和手性柱的影响,其中,起决定性因素的还是手性柱,一方面可以将3种外消旋体适度分离,另一方面可以将对映体进一步分离; 而C18柱则实现3种外消旋体更充分的分离,这样给手性柱拆分对映体时提供了更多的时间和空间。   进一步考察色谱柱串联模式对氨基酸对映体拆分的影响,   分别采用C18柱在前冠醚柱在后和冠醚柱在前C18柱在后的串联模式进行分离,并与单独使用C18柱分离和单独使用冠醚柱分离进行对照。如图3所示,单独使用冠醚柱仅能部分拆分对映体,色谱峰重叠十分严重,色谱峰之间的空间过于狭小; 单独使用C18柱时,不能拆分对映体,但3种氨基酸外消旋体能很好地分离,有足够的空间距离; C18柱串联冠醚柱或冠醚柱串联C18柱,都能很好地实现3种氨基酸外消旋体的分离,说明串联模式分离多种手性化合物实现了双柱优势互补,取得了满意的分离效果。此外,从图3还可见,串联的先后顺序对分离无明显影响,谱图基本一致,但C18在后时,峰形对称性略差,这是由于氨基酸在C18柱上分离略有拖尾; 反之,当C18在前时,能够得到更好的峰形,这是由于后面的手性柱分离能够一定程度改善峰形。因此,采用C18柱串联冠醚柱分离效果更佳。   实验, C18柱串联手性柱的反相色谱拆分方法,容易实现多种对映体的基线分离,也为多种手性化合物的同时分离提供了新思路。   References   1ZHANG Mei, XI WenHui, ZI Min, PENG Ya, XIE ShengMing, YUAN LiMing. Chinese J. Anal. Chem., 2010, 38(2): 181-186   张 美, 奚文汇, 字 敏, 彭 雅, 谢生明, 袁黎明. 分析化学, 2010, 38(2): 181-186   2SHEN GangYi, GAO Yan, DAI DongSheng, CUI Jian, LIU YuMing, PEI LingPeng. Chem. J. Chinese Universities, 2011, 32(8): 1709-1713   申刚义, 高 妍, 戴东升, 崔 箭, 刘裕明, 裴凌鹏. 高等学校化学学报, 2011, 32(8): 1709-1713   3YU LiJu, HUANG HaiWei, LI XiuMei, SHENG Jia, XU YongWei, HE Lan. Chinese J. Anal. Chem., 2016, 44(9): 1348-1353   庾莉菊, �S海伟, 李秀梅, 盛 佳, 徐永威, 何 兰. 分析化学, 2016, 44(9): 1348-1353   4WU HaiXia, WANG DongQiang, ZHAO JianChao, KE YanXiong, LIANG XinMiao. Chinese J. Chromatogr., 2016, 34(1): 62-67   吴海霞, 王东强, 赵见超, 柯燕雄, 梁鑫淼. 色谱, 2016, 34(1): 62-67   5Ilisz I, Peter A, Lindner W. TRACTrend Anal. Chem., 2016, 81: 11-22   6MU XiaoYu, QI Li, SU Yuan, QIAO Juan, CHEN Yi. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(1): 21-27   木肖玉, 齐 莉, 苏 圆, 乔 娟, 陈 义. 色谱, 2016, 34(1): 21-27   7PAN ZaiFa, TANG XiaoDong, WANG Hong, LIU HuiJun, WANG LiLi. Chinese J. Anal. Chem., 2013, 41(9): 1385-1390   潘再法, 汤晓东, 王 宏, 刘会君, 王丽丽. 分析化学, 2013, 41(9): 1385-1390   8Vaarmann A, Kask A, Maeorg U. J. Chromatogr. B, 2002, 769(1): 145-153   9LIU YuJian, CHEN GuoLin, XU ZhiGang. Chem. Reagents, 2016, 38(7): 595-601   刘育坚, 陈果林, 许志刚. 化学试剂, 2016, 38(7): 595-601   10Zhang Q, Shi H, Gao B, Tian M, Hua X, Wang M. Sci. Total Environ., 2016, 542: 845-853   11Qi P, Yuan Y, Wang Z, Wang X, Xu H, Zhang H, Wang Q, Wang X. J. Chromatogr. A, 2016, 1449: 62-70   12Maia A S, Castro P M L, Tiritan M E. J. Chromatogr. B, 2016, 10291030: 174-183   13Segura T A, Lapasio J R T, Bolsico C O, Coque M C G A. Anal. Chim. Acta, 2016, 923: 1-23   14Sardella R, Lammerhofer M, Natalini B, Lindner W. J. Sep. Sci., 2008, 31: 1702-1711   15Perera R W H, Lough W J. J. Chromatogr. A, 2011, 1218: 8655-8663   16LIU Hao, QIU Ya. Chinese J. Antibiot., 2016, 41(1): 45-49   �� 浩, 裘 亚. 中国抗生素杂志, 2016, 41(1): 45-49   17Kucerova G, Prochazkova H, Kalikova K, Tesarova E. J. Chromatogr. A, 2016, 1467: 356-362   18Tang J, Pang L, Zhou J, Zhang S, Tang W. Anal. Chim. Acta, 2016, 946: 96-103   19LU ZhenYu, WU Peng, ZI Min, YANG CanYu, KONG Jiao, YUAN LiMing. Chinese J. Org. Chem., 2015, 35(1): 217-222   路振宇, 伍 鹏, 字 敏, 杨璨瑜, 孔 娇, 袁黎明. 有机化学, 2015, 35(1): 217-222   AbstractA reversed phase high performance liquid chromatographic (RPHPLC) method was proposed by using C18 column tandem crown ether chiral column for simultaneous separation of three kinds of aromatic amino acid enantiomers. The chromatographic conditions, including mobile phase proportion, pH, column temperature and flow rate, were optimized. The experimental results showed that the three aromatic amino acid enantiomers could be successfully separated under the optimal conditions such as perchloric acid solutionacetonitrile (86∶14, V/V, pH=2) as mobile phase, column temperature of 20℃ and flow rate of 0.4 mL/min. The separation under four HPLC column connection modes was further investigated. The results revealed that different kinds of amino acids could be separated on C18 column, but not for amino acid enantiomers; amino acid enantiomers could be separated on crown ether chiral column, but the chromatographic peaks of each amino acid enantiomers overlapped seriously; baseline separation of three amino acid enantiomers could be obtained under the connection of two columns, but the separation under different column connection sequence almost had no difference except the peak shape.   KeywordsChiral separation; Aromatic amino acids; Enantiomers; Crown ether column

范文七:肾移植患者移植后血清芳香族氨基酸的测定 投稿:莫耞耟

国际检 验医学杂 志 2 0 1 4年 1月第 3 5 卷 第 2期

I n t   J   L a b   Me d , J a n u a r y   2 0 1 4 , Vo 1 . 3 5 , No . 2  

临床 检验 研 究论 著 ・  

肾移 植 患者 移植 后 血 清 芳香 族 氨基 酸 的测定 

肖乐 东   , 郑  淋  , 张  将 。 , 唐爱国  , 莫喜 明   ( 1 . 邵 阳 市第一人 民 医院检 验科 , 湖 南邵 阳 4 2 3 0 0 0 ; 2中南 大学湘雅 二 医院检 验科 , 湖 南长沙 4 1 0 0 1 1 )  

摘 要: 目 的  观 察 肾移 植 患 者 移 植 后 血 清 中的 色氨 酸 ( T y r ) 、 酪氨酸 ( T r p ) 及 苯 丙氨 酸 ( P h e ) 含 量 变化情 况, 并探 讨其 与 肾  

功 能 损 伤 的 关 联 。方 法  用 高效 液 相 色谱 一 荧光 法 ( HP L C — F D ) 测 定 肾移 植 患 者 和 健 康 对 照 组 血 清 Ty r 、 Tr p和 P h e含 量 , 用 自动  生化分析仪测定血清肌 酐、 尿 素氮、 尿酸 、 胱抑 素 C 、 p z 微 球 蛋 白含 量 。分 析 氨 基 酸代 谢 与 肾 功 能之 间 的 关 系。 结 果  肾移 植 后 患  者 血 清 Ty r 、 T r p含 量 与 健 康 对 照 组 比较 差 异 无 统 计 学 意 义 , 分 别为( 6 3 . 9 3 ±1 3 . 7 5 ) v s ( 5 8 . 1 3 ±1 6 . 5 0 ) “ mo l / L和 ( 3 5 . 2 7 ±7 . 8 2 )  

v s ( 3 7 . 1 5 士9 . 3 7 )g mo l / L, P> 0 . 0 5 。P h e 含 量 高 于健 康 对 照 组 [ ( 6 0 . 7 5 4 _ - 1 3 . 5 5 ) v s ( 3 8 . 1 9 ±1 0 . 8 5 )   mo l / L , P <0 . 0 1 ] , 其中  

C KD 3期 患者 P h e浓度 明 显 高 于 C K D 1与 C KD 2期 患 者 ( P <0 . 0 1 ) 。经 相 关 分 析 发 现 , P h e浓 度 与 胱 抑 素 C、 8  微 球 蛋 白 浓 度 存  在 相 关性 。结 论  肾移 植 后 患者 体 内存 在 芳 香 族氨 基 酸 AA A代谢 变化, 这 种 变化 与 肾脏 功 能 的 状 态 密切 相 关 。   关键词 : 色谱 法 , 高压 液 相 ;   氨基 酸 类 ;   肾移 植 

D 0l : 1 0 . 3 9 6 9 / j . i s s n . 1 6 7 3 — 4 1 3 0 . 2 0 1 4 . 0 2 . 0 0 3   文献标识码 : A   文章编号 : 1 6 7 3 — 4 1 3 O ( 2 O l 4 ) 0 2 — 0 1 3 4 一 O 3  

De t e r mi na t i on   o f   a r o ma t i c   a mi n o   a c i d s   i n   s e r u m  of

  p at i e n t s   wi t h   po s t   r e na l   t r a ns pl a nt a t i on  

Xi a o   Le d o n g  , Z h e n g   Li n  , Zh a n g   Ji a n g  , T a n g   Ai gu o  , Mo   Xi mi n g。  

( 1 . De p a r t me n t   o fCl i n i c a l   La b o r a t o r y, t h eFi r s t   Pe o p l e   s   Ho s p i t a l   o f  S h a o y a n g, S h a o y a n g, Hu n a n   4 2 2 0 0 0, Ch i n a;   2 . De p a r t me n t   o fC l i n i c a l   L a b o r a t o r y, t h eS e c o n d   Xi a n g y a   Ho s p i t a l   o fC e n t r a l   S o u t h   Un i v e r s i t y, C h a n g s h a , Hu n a n   4 1 0 0 1 1 , Ch i n a )   Ab s t r a c t : 0b j e c t i v e   To   o b s e r v e   s e r u m  t r y p t o p h a n( Ty r ) , t y r o s i n e( Tr p )a n d   p h e n y l a l a n i n e( P h e )c o n c e n t r a t i o n   c h a n g e   i n  

p o s t — r e n a l   t r a n s p l a n t a t i o n   p a t i e n t s , a n d   e x p l o r e   t h e   c o r r e l a t i o n   o f   a r o ma t i c   a mi n o   a c i d   me t a b o l i c   c h a n g e   wi t h   r e n a l   f u n c t i o n . Me t h o d s  

Ki d ne y   t r an s pl a nt   p a t i e nt s   a nd   he a l t hy   pe o pl e   s e r um  Ty r, Tr p   a nd   Ph e   c o nt e nt   we r e   de t e r mi ne d   by   hi gh   pe r f or ma nc e   l i qu i d   c hr o —  

ma t o g r a p h y — f l u o r e s c e n c e   s p e c t r o me t r y( HPL C— FD) , a n d   a u t o ma t i c   b i o c h e mi c a l   a n a l y z e r   wa s   u

s e d   t o   d e t e c t e d   c r e a t i n i n e , u r e a   n i t r o  

g e n, u r i c   a c i d , c y s t a t i n   C   a n d   1 7 2 一 mi c r o g l o b u l i n   c o n t e n t . Th e   r e l a t i o n s h i p   b e t we e n   a r o ma t i c   a mi n o   a c i d   me t a b o l i s m  a n d   r e n a l   f u n c t i o n  

we r e   a n a l y z e d . Re s u l t s   Co mp a r e d   wi t h   t h e   h e a l t h y   c o n t r o l   g r o u p, t h e   c o n c e n t r a t i o n s   o f   s e r u m  Ty r   a n d   Tr p   i n   p o s t — r e n a l   p l a n t a t i o n  

p a t i e n t s   h a d   n o   s i g n i f i c a n t   d i f f e r e n c e   E ( 6 3 . 9 3 ±1 3 . 7 5 )v s( 5 8 . 1 3 ±1 6 . 5 0 )  ̄ mo l / L ; ( 3 5 . 2 7 ±7 . 8 2 ) v s ( 3 7 . 1 5 ±9 . 3 7 ) I  ̄ mo l / I   , P >  0 . 0 5 ] . T h e   c o n c e n t r a t i o n   o f   s e r u m  P h e   s i g n i f i c a n t l y   i n c r e a s e d   t h a n   t h e   h e a l t h y   c o n t r o l   g r o u p[ ( 6 O . 7 5 ±1 3 . 5 5 )" u s( 3 8 . 1 9 ±1 0 . 8 5 )   u mo l / I   , P< 0 . O l J , w h i c h   C K D3   p e r i o d , p a t i e n t s   P h e   c o n c e n t r a t i o n   wa s   s i g n i f i c a n t l y   h i g h e r   t h a n   C KD1   a n d   C KD 2   p e r i o d   p a t i e n t s  

( P <O . O 1 ) . T h e   c o r r e l a t i o n   a n a l y s i s   s h o we d   t h a t   P h e   c o n c e n t r a t i o n s   c o r r e l a t e d   wi t h   c y s t a t i n   C   a n d   6 2 一 mi c r o g l o b u l

i n   c o n c e n t r a t i o n .  

C o n c l u s i o n   Ao r ma t i c   a mi n o   a c i d ( AAA)me t a b o l i c   c h a n g e   c a n   b e   o b s e r v e d   i n   p o s t - r e n a l   t r a n s p l a n t a t i o n   p a t i e n t s , wh i c h   i s   c l o s e l y   r e l a t e d   t o   t h e   s t a t e   o f   r e n a l   f u n c t i o n .  

Ke y   wo r d s: c hr om a t ogr a phy, hi gh   pr e s s u r e   l i qu i d;   a mi no   a c i ds;   ki dne y   t r a ns p1 a nt a t i on  

芳香族氨基 酸 ( AA A) 是 指含 有芳 香环侧 链 的氨基 酸 , 包 

括苯丙 氨酸( P h e ) 、 酪 氨酸 ( Ty r ) 和色 氨酸 ( Tr p ) 3种 。Tr p是 

蛋 白( B MG) 等多种 肾功 能指标 , 初 步 探 讨 了 肾 移 植 后 患 者 血 

清 Tr p 、 Ty r和 P h e含 量 变 化 情 况 及 其 与 肾 功 能 状 态 的 相 

关性 。  

1 资 料 与 方 法 

人体 内一种必需氨基酸 , 参 与 人 体 蛋 白质 合 成 和 代 谢 调 节 l 。   苯丙 氨 酸 ( P h e ) 是具 有 生 理 活 性 的 氨 基 酸 , 亦 是 人 体 的 必 需 氨  基 酸 之一 。 正 常情 况 下 , P h e主 要代 谢 途 径 是 经 苯 丙 氨 酸 羟 化  酶( P AH) 羟 化作 用 生 成 Ty r 。P AH 是 一 种 单 加 氧 酶 , 主 要 存  在 于肝脏及肾脏 , 催 化 的 反应 不 可 逆 , 所 以 Ty r 不 可 能 转 化 为 

1 . 1 一 般 资 料  于 湘 雅 二 医 院 行 肾 移 植 后 的 患 者 共 1 0 0例 ,  

其 中男 7 1例 , 女2 9例 , 年龄 1 9 ~6 3岁 , 平均 3 8 . 2 2岁 。移 植  时 间 6月 至 7年 , 平均 4 . 2年 。 体 检 健 康 成 人 2 O例 ( X线 、 B  

P h e 。故 T y r 是一种非 必需氨基酸 , 来 源 器 官 主 要 是 肝 脏 和 肾 

脏_ 2 ] 。大 量 研 究 表 明 , 人 体 内 AA A 浓 度 变 化 与 肾 功 能 有 着 密 

超、 心 电图、 血常规 、 血生化 、 内外 科 检 查 等 均 正 常 ) , 男 1 4例 ,   女 6 例, 年龄 2 O ~6 5岁 , 平均 3 8 . 8 5岁 , 作 为 健 康 对 照 组 。纳 

入对象于上午 8 : ( ) ( ) ~1 O : O ¨ 。抽 取 空 腹 静 脉 血 5   mL于 促

凝 管  内, 2   6 5 0 ×g 离心 5   mi n分 离 血清 待 检 。   1 . 2  T y r 、 Tr p和 P h e 的 定 量 测 定  AA A 氨 基 酸 的 测 定 采 用 

切 的 关 系  。 肾移 植 后 患者 体 内 的 肾 脏 滤 过 和 重 吸 收 功 能 基 

本得到恢复 , 但 其 对 AAA 的代 谢 功 能 是 否 恢 复 尚不 明 了 。本  研 究 通 过 同 时 测 定 肾 移 植 患 者 移 植 后 血 清 中 AAA 的含 量 及 

肌酐( C r ) 、 尿酸( UA) 、 尿素氮 ( B u n ) 、 胱 抑 素 c( C y s C ) 、 8  微 球 

本 室 建立 的高 效 液 相 色 谱 程 序 波 长 荧 光 法 进 行 检 测 口 ] 。 色 谱 

*   基金项 目: 湖 南 省 科 技 计 划 项 目( 2 0 1 0 S K3 2 0 5 ) 。   作者简 介 : 肖乐东 , 男, 主任检 验师 , 主要从 事高效 液相 色谱临 床检验 应用 研究 。  

通讯作者 , E   ma i l : mo x i mi n g @y a h o o . c o n. r C F I 。  

1 . 3 5 , No . 2   国际检 验 医学杂志 2 0 1 4年 1月第 3 5 卷 第 2期  I n t   J   L a b   Me d , J a n u a r y   2 0 1 4Vo

— —

・ 

1 35  ・  

条件 : 色谱 柱 为 Me g r e s   C1 8 ( 4 . 6   mmx   2 5 0   F o _ m, 内径 5   m) ,   流 动 相 为 乙腈 水 溶 液 ( 乙 腈 和 水 的 体 积 比为 1: 9 ) , 流速为 1 . 0  

态 分 布 资 料 的组 问 比较 用 Ma n n - Wh i t n e y检 验 , P <O . 0 5为 差  异有统计学 意义 。  

2 结  果 

mL / mi n 。荧光 检测器激 发波 长和发射 波长 : 0 . 0 ~4 . 5   mi n分 

别为 2 2 8   n l T l 和 3 0 6   n m; 4 . 5 ~8 . 0   mi n为 2 1 0   n m和 3 0 0   n m; 8   mi n后 调 至 2 8 5   n m和 3 5 3   n m, 每次进样量 2 O  L 。   1 . 3  C r 、 B u n 、 UA、 C y s   C、 B MG 测 定 利用雅 培 C 一 8 0 0 0全 自  

2 . 1   肾 移 植 后 患 者 与健 康 成 人 肾 功 能 指 标  肾 移 植 后 患 者 按 

血清C r 值 分 为 肾功 能正 常组 ( A组 , C r Y. 1 3 3   p mo l / L, 3 8例 ) 、  

肾 功 能代 偿 组 ( B组 , c r < 1 7 7   p t mo l / L, 4 0例 ) 和 肾 功 能 失 代 偿  组( C组 , Cr  ̄4 5 0“ mo l / L, 2 2例 ) 。肾 移 植 后 患 者 与 健 康

对 照  血清 C r 、 B u n 、 UA、 C y s C、 B MG 水 平 见 表 1 。随 着 血 清 c r 水 平  的上升 , 其 他 反 映 肾 脏 滤 过 和 重 吸 收 功 能 的指 标 也 明显 升 高 。  

动生化 分析仪进行测定 , 其 中 Cr 、 B u n 、 UA 采 用 酶 法 检 测 , C y —   s C、 B MG 采 用 透 射 免 疫 比浊 法 进 行 检 测 。  

1 . 4 统计学处理 用S P S S   1 9 . 0软 件 进 行 分 析 , 均 数 用  ±  

表示 , 正态 分 布 资 料 的组 间 比 较 用 两 独 立 样 本 的 t 检验 , 非 正 

表1   肾移 植 后 患 者 与 健 康成 人 肾功 能 5项 结 果 f  士   )  

2 . 2 健康成人 与 肾移植 后患 者血 清 T y r 、 P h e和 T r p含 量  2 0例 健 康 成 人 和 1 0 0例 肾移 植 后 患 者 血 清 Ty r 、 P h e 和 Tr p浓 

度, 见表 2 。与 健 康 人 比 较 , 肾 移 植 患 者 血 清 Ty r 、 T r p含 量 无  明显减 少 , 差异无 统计 学意 义 ( P> 0 . 0 5 ) , 而 P h e含 量 明 显 升  高, 差异有统计学 意义( £ 一5 . 2 6 0 , P< 0 . 0 1 ) 。   表 2   肾移植患者与健康人血 清 T y r 、 Tr p和 P h e的 

含量 ( i士s , / l mo l / L)  

P一 0 . 0 0 0 ) , T r p与 UA、 B MG 有 一 定 的 相 关 性 , 见表 4 。   表4   肾移 植 后 患 者 血 清 T y r 、 P h e 及 Tr p与 肾功 能  生 化 指 标 的 相 关 性 

P<7  ̄0 . 0 1 , 与 健康 对 照组 比 较 。  

3 讨 

论 

2 . 3   肾移 植 患 者 不 同 亚 组 间 血 清 Ty r 、 P h e和 Tr p含 量 的 比 

依 据移植后患者 的肾功 能状 态 , 肾 移 植 患 者 被 分 成 了 A、  

肾脏在人体 中起到 排泄 、 生 物 合 成 和 新 陈 代 谢 的 重 要 作  用, 其 功 能受 损将 影 响 人 体 正 常 的 生 理 功 能 。AAA 作 为 一 类  含 特 殊 结 构 的氨 基 酸 , 其参 与 体 内许 多 的 正 常 生 理 代 谢 与 物 质 

合成[ 8 ] 。现 有 研 究 证 实 肾脏 是 P h e向 Ty r 转 化 的 一 个 重 要 器 

B、 C   3组 。对 这 3组 患 者 血 清 中 Ty r 、 P h e和 T r p含 量 进 行 比 

较, 见表 3 。肾功能正 常 组与 肾功 能代 偿 组相 比 , T y r 、 Tr p和 

P h e 浓度无 明显差异 ( P >0 . 0 5 ) , 肾 功 能 失 代 偿 组 与 肾 功 能 正 

官l _ g ] 。健 康 人 由 于 其 P AH 活 性 正 常 , 体 内的 P h e向 Ty r转 

化,

P h e 和T y r 含量均维 持在 正常水 平 。同时 , 肾 脏 产 生 色 氨 

常组 、 肾功 能 代 偿 组 相 比, Ty r 、 Tr p浓 度 无 明 显 差 异 ( P> 

0 . 0 5 ) , 但P h e 浓 度显著升高 ( P <0 . 0 1 ) 。  

表 3   肾移 植 后 患 者 不 同分 期 之 间 血 清 T y r 、 P h e 和  T r p含 量 (  ±s , /  ̄ mo l / L   J  

酸双加 氧 酶 和 吲 哚 胺一 2 , 3 一 双加氧酶 ( I D O) , 影 响 Tr p 的 代 

谢l 1   。在 肾 功 能 衰 竭 时 , AAA 的 代 谢 会 发 生 改 变 。在 临 床  中, 成 年 肾功 能 衰 竭 的 患 者 , 可通过移 植一个 。 肾脏 来 基 本 满 足 

对 人 体 排 泄 有 毒 物 质 的需 要 , 但 能 否 纠 正 物 质 代 谢 的紊 乱 和 肾  脏 分 泌 的各 种 酶 或激 素 , 尚不 清 楚 。 肾移 植 患 者 极 易 发 生排 斥  反应『 1  , 虽 然 可 以通 过 使 用 免 疫 抑 制 剂 来 抑 制 排 斥 反 应 的 发  生, 但 只 能 降 低 排 斥 反 应 发 生 的概 率 , 而 不 能 全 部 避 免 。所 以 ,  

P( O . O 1 , 与 C组 比较 。  

患者仍可能 面临着各种排斥反应 , 移 植 肾 的 功 能将 受 到 不 同 程 

度 的损 伤 。   研究结 果显示 , 在 肾移 植 后 的 患 者 中 , 虽 然 移 植 后 A 组 患  者 肾功 能 以 c r 的参 考 值 为 标 准 认 为 在 正 常 范 围 , 但 与 同龄 的 

2 . 4 肾移植后 患者 血清 T y r 、 P h e 和 T r p含 量 与 其 他 肾功 能  生 化 指 标 的 相 关 性 分 析  对 1 0 0例 肾 移 植 后 患 者 血 清 Ty r 、   P h e和 T r p 含 量 与 血 清 中其 他 反 映 肾 脏 功 能 的 指 标 ( C r 、 B u n 、  

对 照 组 比较 , 仍明显升高 (   一8 . 9 8 5 , P: 0 . 0 0 0 ) 。同时, 反 映 肾  脏滤过 功能较敏感 的指标 C y s C在 。 肾移 植 后 的 各 组 患 者 中都 

UA、 C y s C、 B MG) 进行相 关性分 析 , 结 果表 明 : P h e 与 C r 、 B u n 、  

C y s C、 B MG 有 相 关 性 ( r 分别为 0 . 5 0 7 、 0 . 5 3 1 、 0 . 4 5 9 、 0 . 5 4 7 , 均 

是升高 的( P一0 . 0 0 0 ) 。这说 明进行过 肾移植 ( 下转第 1 3 9页)  

国际检 验医学 杂志 2 0 1 4年 1 月第 3 5 卷第 2 期

I n t   J   L a bMe d , J a n u a r y   2 0 1 4 , V o 1 . 3 5 , N o . 2  

・  

1 39  ・  

思路。   参 考 文 献 

[ 1 ]S a n t

a ma r i n a   F o j o   S , Ha u d e n s c h i l d   C, Ama r   M. Th e   r o l e   o f   h e p a t i c   [ i p a s e   i n   l i p o p r o t e i n   me t a b o l i s m  a n d   a t h e r o s c l e r 0 s i s [ J ] . C u r r   O p i n  

Li p i d o l , 2 0 08, 3 0 ( 3 ): 2 1 1 - 2 1 9 .  

c i a t e d   w i t h   c h o l e s t e r o l   a n d   r i s k   o f   c a r d i o v a s c u l a r   e v e n t s [ J ] . N   E n —  

g l   J   Me d, 2 0 08, 3 5 8 ( 1 2 ) : 1 2 4 0 ~ 1 2 4 9 .  

[ 9 3  Ve g a   GL, Ga o   J , Be r s o t   TP , e t   a 1 . T h e一 5 1 4   p o l y mo r p h i s m  i n   t h e  

h e p a t i c   l i p a s e   g e n e (L I PC) d o e s   n o t   i n f l u e n c e   a n d r o g e n — me d i a t e d  

s t i mu l a t i o n   o f   h e p a t i c   l i p a s e   a c t i v i t y [ J ] . J   L i p i d   Re s , 2 0 0 7 , 4 6 ( 7 ) :  

l 5 2 0 — 1 5 2 4 .  

[ 2 3  S a n t a ma r i n a — F o j o   S, Go n z a l e z — Na v a r r o   H, F r e e ma n   L, e t   a 1 .He —   p a t i c   l i p a s e , l i p o p r o t e i n   me t a b o l i s m, a n d   a t h e r o g e n e s i s [ J ] . Ar t e  

r i o s e l e r   Th r o mb   Va s c   Bi o 】 , 2 0 04 , 32 ( 1 O ): 1 7 5 0 一 l   7 54 .  

[ 1 0 ]Ni e   I   , Wa n g   J , C l a r k   L T. B o d y   ma s s   i n d e x   a n d   h e p a t i c   l i p a s e   g e n e  

( L I P C )p o l y mo r p h i s m  j o i n t l y   i n f l u e n c e   p o s t h e p a r i n   p l a s ma   h e p a t —  

i c   l i p a s e

  a c t i v i t y [ J ] . J   L i p i d   Re s , 2 0 0 6, 4 7 ( 5 ) : 1 1 2 7 — 1 1 3 O .   [ 1 1 ]Ni e   L, Ni u   S , Ve g a   GL . Th r e e   p o l y mo r p h i s ms   a s s o c i a t e d   wi t h   l o w   h e p a t i c   l i p a s e   a c t i v i t y   a r e   c o mmo n   i n   Af r i c a n   Ame r i c a n s [ J ] . J  

Li p i d   Re s , 2 0 0 8, 4 9( 9 ) : 1 9 0 0 — 1 9 0 3 .  

I - 3 ] J a n s e n   H, Ve r h o e v e n   AJ , S i j b r a n d s   E J . He p a t i c   l i p a s e : a   p r o — o r   a n t i a t h e r o g e n i c   p r o t e i n [ J ] . J   L i p i d   R e s , 2 0 0 8 , 4 9 ( 9 ) : 1 3 5 2 — 1 3 6 2 .  

E 4 ] Gu e r r a   R, Wa n g   J , Gr u n d y   S M, e t   a 1 . A  h e p a t i c   l i p a s e ( L I P C)a l —  

l e l e   a s s o c i a t e d   wi t h   h i g h   p l a s ma   c o nc e n t r a t i o n s   o f   hi g h   d e n s i t y   l i p —  

[ 1 2 ]He g e l e   RA, T u   L, Co n n e l l y   P W. Hu ma n   h e p a t i c   l i p a s e   mu t a t i o n s  

o p r o t e i n   c h o l e s t e r o l [ J ] . P r o c   Na t l   Ae a d   S c i   US A, 2 0 0 7 , 1 0 0 ( 9 ) :  

4 5 3 2 - 4 5 3 7 .  

a n d   p o l y mo r p h i s ms [ J ] . Hu m  Mu t a t , 2 0 0 7 , 1 5 ( 4 ) : 3 2 0 — 3 2 4 .   [ 1 3 ]金 磊 , 倪 培华 , 应雅韵. 肝 脂酶 基 因 一 7 6 3 A/ G 多 态 性 与 混 合 型 高 

脂 血 症 的 关 系 口] . 检 验 医学 , 2 0 1 0 , 2 5 ( 2 ) : 1 2 6 — 1 3 1 .  

E s ] C o u t u r e   P, Ot v o s   J D, C u p p l e s   L A, e t   a 1 . As s o c i a t i o n   o f  

t h e   C - 5 1 4 T  

p o l y mo r p h i s m  i n   t h e   h e p a t i c   l i p a s e   g e n e   wi t h   v a r i a t i o ns   i n   l i p o p r o —  

[ 1 4 ]S h i   YY, He   L . S HE s i s , a   p o we r f u l   s o f t wa r e   p l a t f o r m   f o r   a n a l y s e s  

o f   l i n k a g e   d i s e q u i l i b r i u m, h a p l o t y p e   c o n s t r u c t i o n, a n d   g e n e t i c   a s —  

r e i n   s u b c l a s s   p r o f i l e s : t h e   F r a mi n g h a m   o f f s p r i n g   s t u d y [ J ] . Ar t e —  

r i o s c l e r   Th r o mb   Va s c   B i o l , 2 0 00, 2 6 ( 3 ): 8 1 5 - 8 22 .  

s o c i a t i o n   a t   p o l y mo r p h i s m  l o c i [ J ] . Ce l l   Re s , 2 0 0 5 , 1 5 ( 2 ) : 9 7 — 9 8 .   [ 1   5 ]G o l d b e r g   I J . As s o c i a t i o n   o f   p l a s ma   l i p o p r o t e i n   w i t h   p o s t h e p a r i n   l i p a s e   a c t i v i t i e s [ J ] . J   C l i n   I n v e s t , 2 0 0 8 , 4 0 ( 1 1 ) : 1 2 1 1 - 1 2 2 1 .   [ 1 6 ]P e r r e t   B, Ma b i l e   L, Ma r t i n e z   I   , e t   a 1 . He p a t i c   l i p a s e : s t r u c t u r e /   f u n c t i o n   r e l a t i o n s h i p , s y n t h e s i s , a n d   r e g u l a t i o n [ J ] . J   L i p i d   R e s ,  

2 0 0 2, 4 3 ( 8 ): 1 1 6 3 — 1 1 6 9  

[ 6 ] Mu r t o m  S, Ta h v a n a i n e n   E, An t i k a i n e n   M.He p a t i c   l i p a s e   g e n e  

p o l y mo r p h i s ms   i n f l u e n c e   p l a s ma   HDL   l e v e l s: Re s u l t

s   f r o m  Fi nn —  

i s h   E ARS   p a r t i c i p a n t s [ J ] . Ar t e r i o s c l e r   Th r o mb   Va s c   B i d, 2 0 0 8 ,  

3 4 ( 1 0 ): 1 8 7 9 ~ 1 8 8 4 .  

[ 7 ] An d e r s e n   RV, Wi t t r u p   HH, Ty b j a e r g — Ha n s e n   A, e t   a 1 . He p a t i c   l i —  

p a s e   mu t a t i o n s, e l e v a t e d   h i g h — d e n s i t y   l i p o p r o t e i n   c ho l e s t e r o l 。 a n d  

i n c r e a s e d   r i s k   o f   i s c h e mi c   h e a r t   di s e a s e : t h e   Co p e n h a g e n   c i t y   h e a r t  

[ 1 7 ]B a i r d   AE . B l o o d   g e n o mi c s   i n   h u ma n   s t r o k e [ J ] . S t r o k e , 2 0 0 7 , 3 8  

( Su p p l   2 ): 6 9 4 — 6 9 8 .  

s t u d y [ J ] . J   Am  C o i l   C a r d i o l , 2 0 0 8 , 4 6 ( 1 1 ) : 1 9 7 2 — 1 9 8 2 .   [ 8 ] Ka t h i r e s a n   S, Me l a n d e r   O, An e v s k i   D, e t   a 1 . P o l y mo r p h i s ms   a s s o 一  

( 收 稿 日期 : 2 0 1 3   0 9 — 0 8 )  

( 上接第 1 3 5页 )  

n e y   f a i l u r e [ J ] . J   Nu t r i , 2 0 0 7 , 1 3 7 ( S u p p l   1 ) : ¥ 1 5 8 6 — 1 5 9 0 .  

e s   B, Ro b e r t   A, M [ 4 ]   Yv a ur e e n   B, e t   a 1 . I mp a i r me n t   of   p h e n y l a l a n i n e  

的患者 中, 移 植  肾的 慢 性 损 伤 过 程 是 普 遍 而 持 续 存 在 的 , 只 是 

程 度的不 同。   同时实验结果 显示 : 进行 过 。 肾移 植 的 患 者 Ty r 、 T r p水 平  与 健康 对 照 组 人 群 的 差 异 无 统 计 学 意 义 , 而P h e 水 平 明 显 升 

c o nv e r s i o n   t o   t y r o s i n e   i n   e n d — s t a g e   r e n a l   d i s e a s e   c a

u s i n g   t y r o s i n e  

d e f i c i e n c y [ J ] . I S N, 2 0 0 8 , 6 6 ( 5 ) : 5 9 1 — 5 9 6 .  

wl a k   D, Ta n k i e wi c z   A, M ys l i wi e c   P, e t   a 1 . Tr y p t o p h a n   me t a b o —   [ 5 ]  Pa l i s m  v i a  t h e  k y n u r e n i n e  p a t hwa y   i n  e x pe r i me n t a l  c h r o ni c  r e n a l  

高, 且 随着 肾 功 能 变 化 , 肾功能受损严 重时 , P h e明 显 升 高 。 相 

关 分析结果表 明 , 血清 P h e 浓度与 C r 、 B u n 、 C y s c 、 B MG 具 有 相 

f a i l u r e [ J ] . Ne p h r o n , 2 0 0 2 , 9 0 : 3 2 8 — 3 3 5 .  

a i t o   A, Ni wa   T, Ma e d a   K, e t   a 1 . Tr y p t o p h a n   a n d   i n d o l i c   t r y p t o—   [ 6 ]  S

关 性 。 可 能 一 方 面 是 因 为 随 着 肾 单 位 的逐 渐 破 坏 , 残 存 的 肾 单  位越来 越少 , 生成 的 P AH、 I D O 酶活 性 明显 减弱 , P h e由 于 转 

化 受阻而水平升高l 1   。另 一 方 面 , 随着 肾 脏 滤 过 功 能 的 受 损 ,  

p h a n   me t a b o l i t e s   i n   c h r o n i c   r e n a l   f a i l u r e [ J ] . C l i n   Nu t r , 2 0 0 8 , 3 3  

( 1 3 ): 1 4 0 2 — 1 4 O6 .   A  Y, Ta n g   AG, Mu   S .H PLC - FI   D  d e t e r mi n a t i o n   o f   s e r u m  a r o —   [ 7 ]  I ma t i c   a mi n o   a c i ds : Ap p l i c a t i o n   i n   c hr o ni c   ki dn e y   d i s e a s e   p a t i e n t s  

肾脏 对 体 内 有 害 物 质 的排 泄 作 用 下 降 , 而过高 的 P h e 在 体 内 是 

种 神 经 毒 性 物 质 。Ty r 作为一种非必 须氨基 酸 , 其 可 通 过 饮 

[ J ] . Cl i n   C h i m  Ac t a , 2 0 1 1 , 4 1 2 ( 1 0 ) : 1 0 3 2 — 1 0 3 5 .  

[ 8 J  P e n e h a r z   P B, Hs u   J W, B a l l   RO. Ar o ma t i c   a mi

n o   a c i d   r e q u i r e me n t s  

食、 蛋 白质 降解 以及 P h e转 化 等途 径保 持其 在 体 内的代 谢 平 

衡。   综 上所 述 , 肾功 能 状 态 与 AAA 的 代 谢 密 切 有 关 , 肾 移 植 

i n   h e a l t h y   h u ma n   s u b j e c t s [ J ] . J   Nu t r , 2 0 0 7 , 1 3 7 ( S u p p l   1 ) : S 1 5 7 6 一  

l 5 7 8 .  

后患 者体 内 出现的 A AA 代 谢 变 化 可 能 对 其 疾 病 的 进 展 与 愈 

后有密切 的联系 , 有 待更深入地研究来 阐明。   参 考 文 献 

[ 1 ]  胥 飚 , 杜 燕娥 , 曾乾娜 , 等. 慢 性 乙 型 肝 炎 患 者 色 氨 酸 和 犬 尿 氨 酸 

[ 9 ] Na i r   KS . Ami n o   a c i d   a n d   p r o t e i n   me t a b o l i s m   i n   c h r o n i c   r e n a l   f a i l —  

u r e [ J ] . J   R e n   Nu t r , 2 0 0 5 , 1 5 ( 1 ) : 2 8 — 3 3 .  

[ 1 o ]李剑欣 , 张绪 梅, 徐琪 寿. 色氨酸 的生理生 化作用及其应 用[ J ] . 氨 

基 酸 和 生 物资 源 , 2 0 0 5 , 2 7 ( 1 ) : 5 8 — 6 2 ,  

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植杂志 , 2 0 0 8 , 1 0 ( 5 ) : 4 2 3 — 4 2 8 .  

的检 测 及 意 义 [ J ] . 重庆医学 , 2 0 1 l , 4 0 ( 3 ) : 2 4 8 — 2 4 9 .  

l e r   N, M [ 2 ]  M ol e e k   S, Bi g e l o w  M, e t   a 1 .The   ki d n e y   i s   a n   i mp o r t a nt  

[ 1   2 ]S u n   J , S h a n n o n   M, An d o   Y, e t   a 1 .S e r u m  me t a b o l o mi c   p r o f i l e s   f r o m  p a t i e n t s   wi t h   a c u t e   k i d n e y   i n j u r y : a   p i l o t   s t u d y [ J ] . J   C h r o m 

a t o gr   B  An a l y t   Te e h n o l   Bi o me d   L i f e   S e i , 2 0 1 2, 2 8 ( 2 ): 1 0 7 — 1 1 3 .  

s i t e   f o r   i n   v i v o   ph e ny l a l a n i ne — - t o — — t y r o

s i n e   c o n v e r s i o n   i n   a d u l t  h u — -  

ma n s : A   me t a b o l i c   r o l e   o f   t h e   k i d n e y [ J ] . P NAS , 2 0 0 8 , 1 0 2( 3 ) :  

1 2 4 2 — 1 2 4 6 .  

[ 3 ]  Ko p p l e   J D. Ph e ny l a l a ni n e   a n d   t y r o s i n e   me t a b o l i s m  i n   c hr o n i c   k i d 一  

( 收稿 日期 : 2 0 1 3   0 8 — 1 8 )  

范文八:高效液相色谱法快速测定血清中的芳香族氨基酸 投稿:陈狜狝

!"".年.月Y2@=;!"".

色谱

!"#$%&%’()*$+,("*(.+/(*+"!T:-*!%A:*!

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高效液相色谱法快速测定血清中的芳香族氨基酸

文江平,唐爱国

(中南大学湘雅二医院临床检验教研室,湖南长沙))%""%%

摘要:采用高效液相色谱紫外检测法分离测定了血清中的芳香族氨基酸。采用的色谱柱为>#2?,@9A:B2#C2DE%&柱(),流动相为乙腈水(体积比为$,)溶液,流速为%/,检测波长为)"1,%/"11F.G’113GHG#I’)J.G)G"1K1358

(体积分数)高氯酸溶液去除蛋白质后取上清液直接进样,!%/51。血清标本经/L%"135内完成测定。探讨了流动相的8蛋白质沉淀剂以及检测波长等因素对分离度和灵敏度的影响。考察了其他%J及其有机相的比例、"余种氨基酸、多巴胺类等物质对目标组分检测的干扰。该方法的日内、日间测定的相对标准偏差均小于/芳香族氨L,基酸测定的线性范围、检测限、回收率等均满足临床检验的要求。结果表明:该方法简便、快速、准确、可靠,适用于临床和科研工作。

关键词:高效液相色谱法;芳香族氨基酸;苯丙氨酸;酪氨酸;色氨酸;血清中图分类号:M$/&

文献标识码:N

文章编号:()%"""#&(%.!""."!#"%/)#")

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(J,CKE#ST)429H,B,-:,HQ:@?;,H,?,@1352?3:5:Q2@:12?3=2135:2=3H9359,@2?,@9A:B2#C2DE:-

,35?,@H22@32?3:59:Q?;,1,?;:H4,@,2--43?;35/L*N--2==,?25=,=@3?,@32Q:@-35,2@3?@25,-313?VB8V7:QH,?,=?3:525H@,=:B,@,@,1,?35=:1-325=,43?;,9?2W-39;,H=-353=2-9?

,,,,W,,5H,1:59?@2?,H?;2??;,1,?;:H39931-,Q29?2==

;?@?:;259,@

人体必需氨基酸,在生命活动中起着极为重要的作用。芳香族氨基酸的代谢情况在肝、肾、神经精神疾

[,]%!等疾病诊断中有重大意义。因此定量分析血病

[].#/括高效液相色谱法(J、毛细管电泳法CKE)[][]$((E、质谱法(Y)等等。其中J0)XCKE是分析

芳香族氨基酸的常用方法。J邻苯二甲醛CKE#

(M衍生法为经典方法的代表,其灵敏度高并可CN)

以同时测定!但是样品处理复杂,需"余种氨基酸;梯度洗脱,衍生产物不稳定。也有研究人员利用芳

[,]&’香族氨基酸能产生自然荧光的特性来测定,获

液中的芳香族氨基酸不仅在蛋白质化学和评价病人的营养状况方面十分重要,而且在多种疾病的诊断治疗和病因学研究上十分关键。

目前,临床测定芳香族氨基酸的方法有许多,包

收稿日期:!""!#"$#%&

作者简介:文江平,男,硕士研究生*%’()年生,

,得了较好的结果,但是由于C;,+@和+@V8的荧光特性不一致而不能在同一波长下同时进行.种氨基

通讯联系人:唐爱国,男,教授,:(),:+,-"(.%///"!/&0#123-4,532535%!!)!9:;

第;期

文江平等:高效液相色谱法快速测定血清中的芳香族氨基酸

・322・

[]!酸的测定,因此不能满足某些疾病的临床诊断与

微孔滤膜过滤,使用前超声脱气;。1K?G

!"$"#标准溶液的配制

()称取%,,,分别3"$7-"C."C.1T1K%%:B各3S用;制T2X的高氯酸溶液溶解并稀释至31T1K%,成//5Y311KK8@%的$7-标准储存液,2Y211KK8@%的C/.标准储备液,4YN11KK8@%的C.:B标准储备液,于Z(;)使用前分别取)种)1[冰箱中保存。标准存储液各1加;T3K%于一小试管内,T2X的高氯酸溶液至3K制成混合标准应用液(含$%,7-531

///,置于4K8@%,C.221!K8@%,C.N1!K8@%):B4!

监测需要。本文在前人研究的基础上建立了高效液紫外检测法(#,可用于生物样品相色谱"$%&"’()

中上述)种芳香族氨基酸的同时测定。结果表明,该方法无需衍生与梯度洗脱,简单、快速,可以广泛应用于基础研究和临床疾病的诊疗。

!实验部分

!"!仪器与试剂

包括:*+,-./公司$&011型高效液相色谱仪,31色谱泵,405紫外检测器,$&011数据处理系统;7-89:-!!;2进样器;?@@?"A纯水器(>?@@?B8.-公司);CD%%"30台式高速冷冻离心机

(江苏太仓医疗器械厂);EE";21电子天平(F-GH-.IG/,.JK-G,8KB+G:,’

+G)。%"苯丙氨酸($7-)、%"酪氨酸(C:.)、%"色氨酸C.B

)、%"丙氨酸(E@+)、%"蛋氨酸(>-,)、%"缬氨酸(+@)、%"异亮氨酸(I@-)、%"亮氨酸(%-J)、2"羟色胺2"#C)、2"羟吲哚乙酸(2"#IEE)、去甲肾上腺素OR)等均购于

K+公司;肌酐(&.)标准液(北京中生生物工程高技术公司,批号131)13,规格;%,浓度3);T5!K8@/%);高氯酸(优级纯,北京南尚乐化工厂);三氯乙酸(?@@?"A纯水器处理的超纯水。"#色谱条件

色谱柱:O8H+"$+U&30柱

(4!K,321KKV)TNK?T9T,*+,-./公司);流动相:乙腈"水(体积比为WN4),用冰乙酸调节B#至)T4;流速:3T1%/K?G;进样量:;1!%;室温下测定;紫外检测波长:;32GK。"$实验方法

"$"!应用试剂的配制

(3)蛋白质沉淀剂:用超纯水分别配制体积分数为;T2X和2T1X的高氯酸溶液、1T5K8@/%的三氯乙酸溶液、1T4K8@/%的磺基水杨酸溶液。(;)干扰样品溶液:用;T2X的高氯酸溶液分别配制)Y111KK8@/%的OR,2Y!11KK8@/%的2"#C和2Y;11KK8@/%的2"#IEE。

())流动相的配制:取乙腈加水制成5X(体积分数)的乙腈水溶液,用冰乙酸调节B#)T4(每311%流动相中加入311!%冰乙酸),再用1T42!K

[冰箱中保存(该溶液在;个月内稳定)。!"$"$血清样品的收集与处理

样品的收集:取研究对象空腹(上午0"N时)静脉血;K%,置于普通洁净试管内,采血后)1K?G内以)111./K?G的速率离心分离血清(若不能及时检测则应置于Z)1[冰箱内保存)

。样品的处理:取;11!%血清置于子弹头形塑料离心管内,加入等体积的2X高氯酸溶液,加盖后于旋涡混匀器上混匀1Y2"3K?G,室温下放置31"32K?G以充分沉淀血清中的蛋白质,然后以31111./K?G的速率离心2K?G,取上清液;1!%进样分析。!Y$Y%$7-,C:.和C.B的定性定量分析

$7-,C:.和C.B采用峰保留值比较法和叠加法进行定性分析;用外标法测定峰面积进行定量分析,数据处理均由$&011色谱工作站完成。

!"$"&统计分析

本实验的所有统计分析均由

#结果与讨论

#"!分离条件的影响与优化

#"!"!检测波长的选择

取一定量的芳香族氨基酸混合标准溶液,用流动相稀释后,经紫外"可见分光光度计在3N1");1GK内扫描。结果显示:在3N1";12GK处,试剂峰较高,严重影响C:.的测定;在;32GK处,$7-,C:.和C.B均有较灵敏的响应,且干扰小、分离佳,便于检测。故选择;32GK作为检测波长。

#Y!Y#流动相B#值对分离效果的影响

由于被分离组分中$7-,C:.和C.B的B"值分别为2T40,2T55,2T0N,因此,通过调节流动相的B#值,使其低于组分的B"值来抑制样品组分的离解,增加组分在固定相中的溶解度(#值增大,!6增加),从而达到分离的目的。本文通过改变流动相的

26&((((K!K5K!!K

・色谱

第’#卷

研究了流动相的!"值,"值对分离效果的影响。!

图#为流动相!"值不同时血清中各目标组分的保

随!各个组留情况。从图#可以看出:"值的降低,分的保留时间相应延长;各组分均分离"$%&时,!

较好。因此选择流动相的!。"值为$%&

第J期

文江平等:高效液相色谱法快速测定血清中的芳香族氨基酸

表!"种芳香族氨基酸的回归分析结果及最低检测限#$%&’!(’*’++,-.$.$&+,+-01$&,%*,2,-.13*4’+$.55’2’12,-.&,6,2+-0!$6,.-$1,5+)/

・?:O・

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AB+%3’3’%$%+6

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,/,!#:(&%(+%1-’1$&%#&32;":FG.>H&%)$1$&%.’-+1B+.’#+’.$%I$>!>+’E’-+’,C!!

和日间测定精密度的试验,结果见表J。

表7"种芳香族氨基酸的日内和日间测定的精密度

#$%&’78*’1,+,-.+-0,.2*$5$.5,.2’*5$/$/

5’2’*6,.$2,-.-0"$6,.-$1,5+再按照“”节的样品处理过程及“”节的色谱?>!>J?>J条件进行分析测定。色谱分析表明:在本文的色谱条件下,干扰物质与待分析物质(5,,)分-AB+5-6C离良好,,,/"3’K3+:STK"",:ST5,H-的线性检测上

K%1-’)’6(%7?J)K%1+-)’6

(%7?@)"#$%&’($)(#+’%LM4)/*M4/(#+’%LM4)/*M4

/(#&3/2)N(#&3/2)N56

-&.$%+=@>OL?>::?>O9==>;LJ>!DJ>@@AB+%63’3’%$%+=:>:LJ>J;J>:O@O>JLJ>O@!>995-6C1&C

B’%!@>9L;>:!

?>D?

!O>DL;>9J

J>D@

979:加标回收率的考察

取混合血清样品?P@#2分成D份,每份;PD2,

其中?份样品加入;P?#2JP:N高氯酸溶液作为基础样品;其余!份分别加入低、中、高!种浓度的混合标准液;P?#2,再按照“?>!>J”节的样品处理过程及“?>J”节的色谱条件进行分析测定。每个样品分析!次,取其平均值计算回收率。结果如表!所示。

表"芳香族氨基酸的回收率(%7!

)#$%&’"(’1-4’*,’+-0$*-6$2,1$6,.-$1,5+(%7!)"#$%&’($)"))+)/I&0%)/*+(&Q+-6

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/(#&3/2)(#&3/2)NN:>::>:

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;>956

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3’3’%$%+JD>DJ:>D?;D>?D>JD;>@!9>D9O>;!>O9>=9>D9:>9J>;5-6C1&C

B’%?9>@?9>;9@>9!>?979;干扰试验

在血清样品中,除了芳香族氨基酸外,其他氨基酸(如"3’,F’3,K3+,2+0,R+1等)和一些含有苯环结构的生物活性物质如:ST5,:STK"",UV,H-等都可能产生紫外吸收而干扰芳香族氨基酸的分析。

将以上这些物质的标准品用JP:N的高氯酸配制一系列浓度的标准液,在本文的色谱条件下分别进样分析。"3’,K3+的保留时间分别为?PO和?P9$%,肌酐为JP::#$%;:ST5为@PJ:#$%;:STK""为PD!#$%;而F’3,R+1,2+0和UV峰与试剂峰共洗脱,未能分离;其他氨基酸在本文色谱条件下未检测到。另外,将以上物质的标准液与血清样品混合后,

下限均比其生理浓度高/低近?;倍,因此,在正常生理或病理条件下,干扰物质是不可能对芳香族氨基酸的分离分析产生干扰。因而,本方法对芳香族氨基酸的分析是特异的,适宜临床疾病指标的监测。9"正常健康人群血清测定结果

随机取样于本院门诊=D位正常健康体检人员(包括血压、心电图、肝胆及肾的W超、胸片、肝肾功能、血糖、血脂、乙肝三对等)均在正常参考范围内,男!@例,女D=例,年龄J?":J岁,平均!?岁)血清进行测定。测定结果如表D所示,与文献[D]比较,AB+的结果一致,56-和5-C稍低。

表:正常健康成人血清中芳香族氨基酸的水平#$%&’:

,.+’*$-0=’$&2=/$53&2+"#$%&’($)R+’%LM4

/(#&3/2)#’3+(%7!@)X+#’3+(%7D=)&56

-&.$%+OO>;L??>;O;>?L?J>:";>;:AB+%63’3’%$%+@O>9LO>!@?>DL9>:";>;:5-1&B’%DD>OL:>O

D;>9L:>?

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参考文献:

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+3&YR,"%)-+Y.Z,U’$-[M>A-&(U’13"(’)M($\M",J;;;,9O(!):?JDJJ]]$)%+-W,2+)&(B&Y.E$R,I0(B.4>2’%(+1,J;;;,!:::O::

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+)$($%+,?99;,?!(:):J@!袁倚盛,方明,沈

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0&>HB$%+.+Z&0-%’3&XHB-&#’1&S,-’CB6

,J;;J,J;(?)::J王清平,唐爱国>色谱,J;;J,J;(?)::J

7(体检各项指标7#[[[[[[[[[7#=

范文九:同步导数荧光光谱法测定食品中3种芳香族氨基酸_朱燕舞 投稿:黄呦呧

同步导数荧光光谱法测定食 品中 种 芳香 族氨 基 酸

朱燕 舞 `, 陈 燕 , 姚 昌中 ' , 窦 焰 `, 江 欢 `, 王 燕,

合肥工业 大学 化学工程学院 , 合肥 合肥市体 育中学 , 合肥

摘 要 提 出 了同步 导数 荧光光谱 法 同时测 定食 品 中 色氨 酸 、酪氨 酸 和 苯 丙氨 酸 的方 法 。 试 验 表 明 为排 除 干扰 , 色氨 酸 、 酪氨 酸和 苯丙氨 酸 的特 征 同步导数 荧光 波 长 宜选 定 , , , 波 长差 以 为 , , 条件 下进行 同步扫 描 。 种芳 香族 氨基 酸 的 浓度 分 别在 一 定范 围 内与

分别为 一, 一 , 一 · 一' 。 其 导数 荧光 强度 呈 线性 关 系 , 检 出限

方法 用 于蜂 蜜 、羊奶粉 和 啤酒样 品 中

中图分类 号 文献标 志码

种芳 香族氛 基酸 的测定 , 回收 率在

文章编号 一 一

之间。

关键词 同步 导数 荧光光谱 法 芳香族氨 基 酸 食 品

, 〔 议 肠

, 矛 了 尹 了,

兮 介 训

, 〕 夕

,

认 夕,

, , 以

,

,

,

呢 , , , 飞 雌 以 ,

,

· 一'

,

· 一 '

一 了

· 一`

, 即

,

色氨 酸 是

、酪氨 酸

和 苯丙 氨酸

要 的作 用

。 由 于 不 同 的食 品 中 氨 基 酸 的 组 成 不

种 含苯环 的芳香 族氨 基酸 , 具 有天 然荧 光 , 是 人

同、 含量 不 同 , 不 同的人 群对 氨基 酸的需 求种 类也 不

体 营养不 可缺少 的 物质 , 在 生 命 活 动 中起 着 极 为 重

收稿 日期 一 一

尽 相 同 , 因此 , 寻找 并 建 立 一种 快 速 、简便 的 芳香 族 氨基 酸测定方 法 ,对 多种 疾 病 的诊 治监 测 和 食 品 营

养 价值评 价 等均有 重要 的意 义仁〕。

基金项 目 安徽省 自然科学 基金

合肥 工业 大

学博士专项基金

项目

一 。

合肥工业大学创新性实验 计划

目前 测定 色氨 酸 、酪氨 酸 和 苯丙 氨酸 的 方法 有

高效液相 色谱 法川 、 氨 基酸 分析 仪法 川 、 毛细 管 电泳 法固 、 高效 液相 色谱一 质 谱 法困 、高效 液 相 色谱 一 荧光 光谱 法圈 和 毛细 管 电泳 一 荧 光 光 谱 法 叫 等 。 其 中荧

作者简 介 朱燕舞 究方向为光学分析 。 一

一 , 女 , 安徽肥 东人 , 副 教授 , 博 士 , 研

光光谱法具有灵敏度 高 、 选择性好等优点 , 但色氨

酸、 酪氨酸和苯丙氨酸三者 的荧光发射光谱 和激发 光谱相互重叠 ,用 常规的荧光光谱法不能实现混合 样中三组分的分别测定 。 同步荧光光谱法具有简化

要 友 概 米 葱 侧

5 0 0 。 5

荧光谱 图 、 提高选择性 、 光散射干扰少等特点 , 适合 复杂样 品及 多组分混合物的分析 〔 一 〕。导数光谱具

有减少光谱干扰 , 放大窄带灵敏度 、抑制宽带 , 增强 特征光谱精细结构的分辨能力等特点 , 其与同步荧 光技 术 相结 合 , 可 进一 步

改善 分辨 能力 、 消除干 扰 。

本 工作 将 同 步 荧 光 与 导 数 光 谱 相 结 合 , 基 于 种 氨基 酸不 同 的同 步 荧 光 光谱 特 性 , 独 立 选 择 同

` — 色氨酸 图 '—

酪氨酸

, '—

苯丙氨酸

种氨基 酸的激发和发射光谱

步荧光波长差 以 , 并对 同步荧光光谱进行一阶导数 处理 , 获得三者的同步导数光谱 , 消除了 种氨基酸 同步特 征峰 之 间的 干扰 , 提 高 了其 测 定 的灵 敏 度与

准确性 , 并 将该 法用 于蜂 蜜 、 羊奶 粉 和啤酒 的测定 。

由图

可 见 色 氨酸 、 酪氨 酸和 苯丙 氨 酸 的激 发 、 和

和发 射 波 长 分 别 为

, 谱线重叠严重 , 彼此干扰 , 用常规的荧 光分析法直接测定将产生较大误差 。

同步波 长差 的选择

试 验部分

仪器 与试 剂

文献报道的同步荧光光谱法测 定 种氨基酸采 用 的是 同一 个 同步 波 长差 以 户 · '。 刁, 试 验 针对 种

型荧 光 分光 光 度计 , 雷 磁 氨基酸 不 同的 同步荧 光 特 性 , 采 用 了 一 型石 得更高 的测定 灵敏 度和 准确度 。 个 以 , 以获 型 超声 波 清 洗 器 ,

型离 心机 。

日立 型 计 , 一

英超 纯水 蒸馏器 ,

色氨酸在不同 以 下的荧光光谱图见图 。

磷 酸 二 氢 钾一 氢 氧化 钠缓 冲溶液 · 一` 磷 酸二 氢 钾 溶 液 和 · 一` 氢 氧化 钠溶 液混合 而 成 。

卿 班 友 似 米 侧

色氨酸 、酪 氨 酸 和苯 丙 氨 酸标 准 储 备溶 液

一 · 一' , 使 用 时 用 磷 酸二 氢 钾一 氢氧 化钠缓 冲溶 液稀 释 至所需浓 度 。

色氨酸 、 酪氨酸和苯丙氨酸为生化级试剂 其余

试剂 均为分 析纯 试验 用水 为二 次蒸馏 水 。

仪器 工作 条件

曲线

所对应的波长差 以 依 次为 。,

,

,

一 。

激发和发射光谱通带宽度均为 管电压为

试验 方法

, 光电倍增 · 一 '。

色氨酸在不同 以 下的同步荧光光谱图

, 扫描速率为

、 一

移取 色氨 酸 、酪氨酸 和 苯丙 氨 酸 标 准储 备 溶 液 各 溶液 定容 至 ,用 磷 酸二 氢 钾一 氢 氧化 钠 缓 冲 。 分取 溶液于

由图

可知 随 以 增 大 , 色 氨 酸 的 同 步荧 光 峰

发生蓝 移 , 且 荧光 强度 增 大 , 考 虑 到 酪 氨 酸 、 苯丙氨

酸的 同步荧光 峰靠 近紫外 , 为使 它们 能 较好 地分 开 ,

试验选 择波 长差 以 为 , 此 时 同步 荧光 峰 入为 。 附近 处的同步荧 处 的 同步 特 征 峰 、同 , 由此可 降低 仪器 测量 边 界处 , 强度适 中且较 靠 近长波 段 。 酪氨酸 在不 同 以 下 的荧 光 光谱 图 见图 由图 可知 酪氨酸在 波长 , 有两个 特征 峰 , 为 避 开 色 氨 酸 光峰 , 试验选 择酪 氨酸 步波 长差 以 为

容量瓶 中 , 用缓冲溶液定容 、 摇匀 。 溶液置于 石英 比色皿 中 , 按仪 器 工 作 条件

进 行 同 步荧 光 光谱

扫描 , 以扣 除空 白后 的 同步荧光 强度绘 制 曲线 。

结果与讨论

激 发和发 射 光谱 种氨 基酸标 准溶 液 的荧光 光谱 图见 图

朱燕舞等 同步导数荧光光谱法测定食品中 种芳香族氨基酸

娜 侧 籍 友 概 来

早 了 `

友 来 卿 契 概 侧

队 卜 日

石 ,

,一 ,乙 一

山 白 ︸

曲线

所对应的波长差 以 依次为

, 。,

,

,

, 。

色氨酸

酪氨酸

— 一 苯 丙氨酸

酪氨酸在不 同 以 下的同步荧光光谱图

、 以

种氨基酸 的同步荧光光谱图

一` 色氨 酸一, 火

· 一` 酪氨 酸 混合 溶 液在

的噪声 , 且荧 光强 度较 强 。 苯丙 氨 酸在 不 同 以 下 的荧光 光谱 图见图

护 , ︸

以 为

时进 行 同步荧 光 扫描 , 并进 行一 阶导数

处理 见 图

卜 鲜 以 ︸

奥 友 米 察 概 侧

、 ﹄ 吸

︸ 一

尸 “ `

白 ` 二二 匕`曰 `

业一

几 又

曲线 一 所对应的波长差 以 依次为

,

,

,

,

色氨酸

酪氨酸

苯丙氨酸 时

苯丙氨酸在不 同 以 下的同步荧光光谱

种氨基酸去除空白后在 从 为 的一阶导数同步荧光光谱

以 一 以

由图

长为 为 别为 ,

可知 当 以 为

时 , 苯丙 氨 酸荧 光

强 度最 强 , 且 峰形 对称 , 此处 苯丙氨 酸 的同步特 征波 , 介 于 酪 氨 酸 与 色 氨 酸 同步 特 征 峰 之 作 为苯丙 氨酸 的 同步波长 差 。 试 验选 取 色 氨 酸 、酪 氨 酸 和 苯 丙 氨 酸 的 以 分 , 。 可知 在 处 酪氨酸 有 一 弱峰 , 对 , 同步 特征 峰分 别 位于 , , 处 。 种氨基 酸 在不 同 以 下 的 同步 荧 光光 谱 图见 图 由图 见图 间 , 因而很好 地 避 开三 者 之 间 的 干扰 , 试 验 选 取 以

'。 “ 、 、 '甘 了 , 毛

、 卜甸 , “ ` —

— — 一

· 一` 色氨酸溶液 · 一'色氨酸一

一阶导 数 同步荧 光波 长的选择 色氨 酸的 测 定 产 生 一 定 的影 响 。 经 一 阶 导 数 处 理 , 色 氨 酸 的一 阶导 数 同步 荧 光 光谱 图 的波 , , 为进 一 步验证 酪 氨酸 处 是 否对 色 氨 酸产 又 · 又 一 峰和波 谷分 别为 生干扰 见 图 一

· 一 ' 酪氨酸混合溶液

色氨酸及色氨酸与酪氨酸混合液 的 一阶导数同步荧光 光谱

的导数 同步 荧光 光谱 在

阴影部 分所 示 。试 验分 别 对

· 一' 色 氨 酸 溶 液 以及

由图

可知 色 氨酸一 酪 氨酸 混合溶 液 与色 氨酸

·

朱燕舞等 同步导 数荧光光谱法测定食品中 种芳香族氰基 酸

的一阶导数同步荧光光谱在波长

处可 以很

由图

可知 在 波长

处 , 色 氨酸 和 酪 氨

好重 叠 , 即应 用一 阶导 数 处 理后 酪 氨 酸 对 色氨 酸 的 干扰 被 消除 。 试验选 取 色氨酸 的一 阶导数 同步

荧光

酸 对苯丙 氨酸 的干 扰 可 以忽 略 , 试 验 选 取 苯 丙 氨 酸

的一阶导数同步荧光波长为 试验分别选取 此进行

波长为

。 测定酪氨酸 的 以 为 。

时, 种

个同步荧光波长差进行一阶导

氨基酸的一阶导数同步荧光光谱见图

数处理 , 获得了 个特征一阶导数同步荧光波长 , 据 种氨基酸的定量分析 , 大大提 高了测定的

灵 敏度 和准确 度 。

体 系酸 度 的选 择

曰 比 日 协 们 ` ﹂

书 叭 、﹄

试 验考 察 了

的 磷酸 二 氢钾一 氢氧

化钠缓 冲溶 液对测 定 的影 响 。 由于 同一 条件 下苯丙

氨酸荧光强度明显低于酪氨酸和色氨酸 , 故取其荧

几 阳

光强度最大时的酸度作为待测体系的酸度 。结果表 明 在 时 , 苯丙氨酸对应 的荧光强度最大 ,

一 一苯丙氨酸

色氨酸

酪氨酸

同时发 现酪 氨酸 和色 氨 酸 的 荧光 强 度 均 有 所提 高 。

试 验选择 干 扰试 验 。为介 质酸 度 。

种氨基酸去除空 白后在 以 为 一阶导数同步荧光光谱

时的

按试验方 法对

一 ·班 一'酪氨 酸溶 液 和

· 一' 色 氨 酸 、

又 一 一 ·

由图

可 知 在 波长

处 , 色 氨酸 和 苯丙

一` 苯 丙氨 酸 溶 液 进 行 测 定 。 结 果 表 明 当相 对 误 差在士 之、 范 围内时 , 、 一、 仇 一、 倍的 认 认 纤、 一、 苏氨酸 、 柠檬 黄 、 葡

氨 酸对酪 氨酸 的干 扰 可 以 忽 略 , 试验 选 取 酪氨 酸 的

一 阶导数 同步 荧光 波长 为 测 定 苯丙 氨酸 的 以 为

。 时 , 种 氨基 酸的

一阶导数同步荧光光谱见图

萄糖 、 蔗糖 、乙醇 , 测 定无影 响 。

倍 的维生素 践 、维生 素

工 作 曲线与检 出 限

按试 验方 法分 别对

﹄﹄ 、 七

种氨 基酸标 准溶 液进 行测

定 , 并进行一阶导数计算分析 , 依据 种氨基酸一阶 导数 同步 荧光波 长处 的导 数荧光 强度 对 相 应浓 度绘

制工 作 曲线 , 其线性 范 围 、 线 性 回归方 程 见表 同时对 空 白溶 液进 行 。 次平 行测 定 , 以空 白溶

又 山

液相对荧光强度的 倍标准偏差 、 除 以线性方程 斜率 计算 方法 的检 出 限 , 结果 见 表 。

— 苯丙氨酸 时的

工 — 图

色氨酸

酪氨酸

方法 的精密 度 按试 验方法 分 别对 溶液 、 火 一 “ 只 。 一 ·一 ` 色氨 酸 又 · 一, 酪 氨 酸 溶 液 和

种氨基酸去除空 白后在 以 为 一 阶导数同步荧光光谱

· 一'苯丙氨 酸溶 液进 行 ,

次 平行 测 定 , 测 , 。

定值 的相对标准偏差依 次为

表 线性 参数和检 出限

琳 份叮 比 盆 肠

化合物

〔 了

线性范围

·

一一 一一

线性 回归方程

一 只

相关 系数

检 出限

·

一 厂 , 以一 石 , 山 ` , ` 十

色氨酸 酪氨酸 苯丙

氨酸

一`

厂 ,「 山

〔 、

朱燕舞等 同步导数荧光光谱法测定食品中 种芳 香族氨基酸

样 品分析

称取蜂 蜜试 样 加人 煮沸的

离 心管 中 ,

文献 一 」 的方法进行样 品前处理 。 将 市售 的啤酒 样 品 脱 气 , 移 取 样品于 容量瓶中 , 用 氢氧 化钠缓 冲溶 液定 容 , 备 用 。

啤酒

磷 酸二 氢 钾一 氢 氧 化钠

磷酸二 氢钾

缓冲溶液 , 放人离心机内 , 在 离心 ,取 上 层 清 液 , 用 氢氧化钠缓冲溶液定容于

称取 某 羊奶 粉试 样

· 一 '转速下 磷 酸 二 氢钾 容量瓶中 , 待用 。

于 水解 管 内 , 按 照

分取一 定体 积 的样 品溶 液 , 按 试 验方 法 对 上述

样 品溶 液进 行测定 , 同时进 行加 标 回收试验 , 结果见 表 。

样品分析结果

样品名称

化合物

色氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸

分取体积

测定值

· 一下

加标量

议, · 一 双,

测定 总量

·

尸︸ 己 叼 ` 八 曰 住 乃 ︺ 门 自 匕 ︹ 了 汀 门 ,︺ 几 乙 乃 ` ﹄ 月 尸 气 匀 性 了

回收率

蜂蜜

以 门 ︶

羊奶粉

色氨酸

岛 曰

曰 ︺讨 八 以 口 ﹄ 匀 ︸

月 八 丹 乙 」 了

酪氨酸 苯丙氨酸

啤酒 色氨酸 酩氨酸 苯丙氨酸

… `

本工作将 同步荧光与导数光谱相结合 , 达到了 改 善分 辨力 、 消 除干 扰 的 目的 , 建立 了同时测 定混 合 体 系中色 氨酸 、酪氨 酸 和 苯 丙氨 酸 的 同步 导 数 荧 光

光 谱法 。方 法用 于蜂 蜜 、 羊 奶 粉及 啤酒 样 品 中

氨基 酸的测 定 , 结 果 满意 。

,

〔〕

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·

范文十:活性炭吸附芳香族氨基酸制备高F值寡肽混合物的研究 投稿:邵惖惗

安徽农业大学学报,2005,32(1):77~80

JournalofAnhuiAgriculturalUniversity

活性炭吸附芳香族氨基酸制备高F值寡肽混合物的研究

韩继福,任建波,王海波,李文亮

(解放军军需大学军需工程系,长春130062)

摘 要:比较了7种颗粒及粉末状活性炭对芳香族氨基酸的吸附能力,选出了最适宜的活性炭品种,并通过均匀试验优化了该活性炭吸附芳香族氨基酸的条件。,结果显示F值>20。

关键词:活性炭;吸附;高F值寡肽混合物  中图分类号:Q94611

A

1672()20077204

高F,在该混合物中,支链氨基酸

(BCAA:Val、Ile(AAA:Tyr、Phe)含量的克分子数比值称为F值(fischerratio),这是为了纪念德国著名学者FischerJE在20世纪70年代提出“伪神经递质假说”而命名的。此比值与改进肝

[1]

脏疾病(肝硬化、肝性脑病)有密切关系,被应用于辅助治疗肝性脑病以及改善手术后和卧床病人的蛋白质营养状况

[2]

,另外它还具有抗疲劳

[3]

、抗缺氧

[4]

以及醒酒的作用

[5]

从寡肽混合物中去除芳香族氨基酸的方法很多,如离子交换法、凝胶过滤法、膜分离法、活性炭吸附色谱法等。而活性炭对苯丙氨酸、酪氨酸有选择性吸附特性,利用这一特性,可将寡肽和芳香族氨基酸分离,且从工业应用方面考虑,活性炭色谱法易推广使用,能大规模地进行生产。据报道,活性炭去除芳香族氨

[6]

基酸的能力与固液比(活性炭与寡肽液体体积比)、寡肽混合液的温度和pH有关。作者就这3个因素探讨用活性炭色谱法去除寡肽混合物中的芳香族氨基酸的最佳条件。

1 材料与方法

111 材料

玉米蛋白粉:长春大成玉米有限公司,预处理后粗蛋白含量为7615%。Alcalase酶:NovoNordisk,酶活力214AU・g。

PapainLG100:BicornIndialimited,酶活力>100TU・mg。

-1

-1

活性炭:吉林省通化信鹏活性炭厂。

TDL25型低速台式大容量离心机:上海安亭科学仪器厂。WFZ8002D2C型紫外—可见分光光度计:北京瑞利分析仪器公司。

日立835250型氨基酸自动分析仪。112 方法

11211 芳香族氨基酸与支链氨基酸的检测 由于寡肽混合物中,高支链氨基酸寡肽在220nm处有最大

吸收峰,芳香族氨基酸在280nm或260nm处有特征性的最大吸收峰,而其它氨基酸对此波长的紫外线无吸收,故用紫外分光光度计检测它们各自的OD值来估测支链氨基酸和芳香族氨基酸含量。11212 活性炭的筛选 Alcalase酶和木瓜蛋白酶水解玉米蛋白粉后的水解液(离心后的上清液),在一定的温度下保温,然后调节上清液的pH值,按照一定的固液比加入粉末或颗粒状活性炭吸附,吸附2h后,

收稿日期:2003210214

基金项目:吉林省重大科技发展计划项目资助。作者简介:韩继福(1963-),男,博士,教授。

78

-1

安徽农业大学学报2005年

3000r・min离心10min,取上清液,测定支链氨基酸与芳香族氨基酸的OD值,计算各自的去除率和保

留率,选出最佳的活性炭。

11213 均匀实验设计 选取固液比(活性炭与寡肽液体体积比)、温度和pH作为考察的3个因素,每因

6

素取9水平,以芳香族氨基酸的去除率和支链氨基酸的保留率为指标,采用U9(9)均匀设计表安排实验(表2),求得各自的回归方程,确定活性炭吸附的最佳条件。

2 结果与分析

由表1可以看出,7号活性炭对AAA的吸附效果最好,有90%以上的AAA被吸附。与其它活性炭相比,虽然7号活性炭对BCAA的吸附较大,但最终考虑的是BCAA与AAA的比值,即F值。因此要在确保高F值的同时,尽量减少BCAA的损失。综合考虑,7号活性炭的吸附效果优于其它活性炭,故选用7号活性炭进行以后的吸附实验(表2)。

表1 Table1 Theadsorptionabilityof吸光度

ODOD220OD260

.101089

092001036

..4No.5

0185801054

1120801065

1150201110

No.60186501050

No.70196501014

  注:活性炭吸附前,OD220为11737,OD260为01147。

Note:Beforeadsorptionofactivecarbon,OD220was11737,OD260was011471

表2 7号活性炭吸附AAA的均匀设计及实验结果

Table2 TheevendesignandexperimentresultsofAAAadsorptionofNo17group

实验号

Groups

123456789

实验因素Experimentfactors

固液比Solid2liquid温度/℃Temperature

1∶101∶151∶201∶251∶301∶351∶401∶451∶50

355530502545204060

pH610410310210710510315215810

OD220OD260

015490196501930110301117511316112661120111545

010010103001030010240104301060010450104201128

表3 7号活性炭对AAA去除率的回归分析

Table3 TheregressionanalysesofremovalratiosofAAAadsorptionofNo17group

项目

Items

常数项Constantitem固液比Solid2liquid温度Temperature

pH

回归系数

Regressioncoefficient

1331913-01847-01394-01316

标准差

Standarddeviation

91473011790117811818

t值tvalueP值Pvalue

141136-41730-21211-21673

01000010050107801044

  由表3可以看出,7号活性炭去除芳香族氨基酸的回归方程为:Y260=1331913-01847固液比-01394温度-01316pH。其中固液比对芳香族氨基酸去除率的影响最大,其次是温度与pH。对回归方程

的方差分析如表4,可看出回归方程有显著性意义(P

表5及表6分别为支链氨基酸保留率的回归分析和对回归方程的方差分析,回归方程为:Y220=221784+11046固液比+01631pH+01160温度。其中固液比对保留率的影响最大,其次是pH与温度,回

归方程有显著性意义(P

7号活性炭吸附芳香族氨基酸的最佳条件为:固液比1∶10,温度35℃,pH610,表7为在此条件下经活

32卷1期韩继福等 活性炭吸附芳香族氨基酸制备高F值寡肽混合物的研究79

性炭吸附后水解液中的氨基酸组成及含量。

表4 AAA去除率回归方程的方差分析

Table4 ThevarianceanalysisofregressionequationtotheremovalratiosofAAA

项目

Items回归Regression残差Residual总和Totalsum

平方和Sumofsquares

20291556232136622611922

自由度

df均方Meansquare

6761519461473

F值FvalueP值Pvalue

35

14155701007

表5 7号活性炭对BCAA保留率的回归分析

Table5 RegressionanalysistotheretainingratesofNo17group

项目Items

常数项Constant固液比Solid2liquid温度Temperature

pH

回归系数

Regressioncoefficient

2217841104601160标准差

Standarddeviation

10188301t值tvalueP值Pvalue

2151078101465

01090010040147001660

保留率回归方程的方差分析

6 varianceanalysisofregressionequationtotheretainingratesofBCAA

项目Items回归Regression残差Residual总和Totalsum

平方和Sumofsquares

17971933306164921041582

自由度

df均方Meansquare

5991311611330

F值FvalueP值Pvalue

358

9177201016

表7 高F值寡肽混合物中氨基酸的种类及含量

Table7 ComponentsandcontentofaminoacidinhighFvalueoligo2peptidemixture

mg・L 

-1

氨基酸种类

Kindsofaminoacid天门冬氨酸Asp苏氨酸Thr丝氨酸Ser谷氨酸Glu甘氨酸Gly丙氨酸Ala缬氨酸Val蛋氨酸Met

BCAAAAABCAA/AAA

组成氨基酸含量Contentsofaminoacid

5195661705511035016522174621171110193021587381070

->20

氨基酸种类Kindsofaminoacid异亮氨酸Ile亮氨酸Leu酪氨酸Tyr苯丙氨酸Phe赖氨酸Lys组氨酸His精氨酸Arg脯氨酸Pro

组成氨基酸含量Contentsofaminoacid

41458221655

------

3 讨论

活性炭吸附芳香族氨基酸的机理还不清楚,一般认为是非极性苯环侧链与活性炭巨大表面间非极性吸附与活性炭含氧基同氨基酸极性基团之间极性吸附的总和。活性炭的种类不同,颗粒大小或目数不同,均影响其对芳香族氨基酸的吸附效果。本试验中采用了7号活性炭进行吸附实验,探讨了固液比、温度及pH对F值的影响,结果表明当固液比为1∶10、温度35℃、pH610时,完全可以达到所要求的F值,与王[6]

梅的试验结果稍有不同,这可能是由于活性炭吸附的水解液不同或者是采用的活性炭目数与种类不同而导致的。

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PreparationofHighFischerRatioOligo2peptideMixture

byAbsorbingAromaticAminoAcidswithActiveCarbon

HANJi2fu,RENJian2en2(DepartmentofMThe)

selectedtostudytheirabsorptioncapacitiesofaromaticaminoacidsandtheopuabsortionconditionwasreachedbyevendesign.Theresultsshowedthatthefischerratiowasmorethan20.

Keywords:activecarbon;absorption;oligo2peptidemixture

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