大肠菌群检测方法_范文大全

大肠菌群检测方法

【范文精选】大肠菌群检测方法

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【专家解析】大肠菌群检测方法

【优秀范文】大肠菌群检测方法

范文一:大肠菌群检测方法 投稿:唐玸玹

大肠菌群检测方法

进入无菌室步骤

1. 进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌,时间为0。5—1小时。

2. 关灯后0•5小时后放可进入。

3. 进入更衣间更换衣服,佩带口罩、帽子、鞋套

实验步骤

1, 进入无菌室后,先把酒精灯点燃,然后在用酒精棉进行手部消毒。(酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成)

2, 准备双料管3根,单料管6根,培养皿7个。

3, 直接从原液中吸取10ml放入双料管,(3根每根各10ml)

4, 再吸取原液1ml放入单料管中(3根每根各1ml)

5, 再吸取原液1ml放入培养皿中(2个培养皿各1ml)

6, 再吸取原液1ml放入盐水管中制成-1梯度的样液

7, 更换一根吸管,从-1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中(3根每根各1ml) 8, 再吸取-1梯度样液1ml放入培养皿中(2个培养皿各1ml)

9, 再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允(注另作3个培养皿:空气空白,把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白,把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白,吸1ml生理盐水放入培养皿中,倒入营养琼脂平铺底部摇匀。)

10, 把全部作好的放入培养箱中,温度36C+-1×C,大肠24H+-2H,菌落48H+-2H,(待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中)

11, 梯度:-1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成

-2梯度为1ml-1梯度样液加入9ml生理盐水配成

-3梯度-4梯度配制方法和-1、-2梯度的配制方法一样

12, 如果大肠初发酵产生气泡,用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C,24H+-2H 。(接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面)

13, 取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌,放入乳糖复发酵管中 ,然后再培养36C+-1C,24H++-2H。

14, 再在伊红美兰平板之字形上挑菌,放到载玻片上作镜检。(方法见标准)

15, 只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下,才能断定这根管是不合格。 16, 清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌,121C,0。5小时同时不能放气。

范文二:大肠菌群检测方法 投稿:姚綖綗

进入无菌室步骤

1. 进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌,时间为0.5—1小时。

2. 关灯后0.5小时后放可进入。

3. 进入更衣间更换衣服,佩带口罩、帽子、鞋套

实验步骤

1, 进入无菌室后,先把酒精灯点燃,然后在用酒精棉进行手部消毒。(酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成)

2, 准备双料管3根,单料管6根,培养皿7个。

3, 直接从原液中吸取10ml放入双料管,(3根每根各10ml) 4, 再吸取原液1ml放入单料管中(3根每根各1ml)

5, 再吸取原液1ml放入培养皿中(2个培养皿各1ml)

6, 再吸取原液1ml放入盐水管中制成-1梯度的样液

7, 更换一根吸管,从-1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中(3根每根各1ml)

8, 再吸取-1梯度样液1ml放入培养皿中(2个培养皿各1ml) 9, 再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允(注另作3个培养皿:空气空白,把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白,把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白,吸1ml生理盐水放入培养皿中,倒入营养琼脂平铺底部摇匀。)

10, 把全部作好的放入培养箱中,温度36℃±1℃,大肠24H±2H,菌落48H±2H,(待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中)

11, 梯度:-1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成

-2梯度为1ml-1梯度样液加入9ml生理盐水配成 -3梯度-4梯度配制方法和-1、-2梯度的配制方法一样

12, 如果大肠初发酵产生气泡,用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36℃,24H±2H 。(接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面)

13, 取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌,放入乳糖复发酵管中 ,然后再培养36℃±1℃,24H±2H。

14, 再在伊红美兰平板之字形上挑菌,放到载玻片上作镜检。(方法见标准)

15, 只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下,才能断定这根管是不合格。

16, 清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌,121℃,0.5小时同时不能放气。

范文三:几种大肠菌群检测方法的比较 投稿:范鑆鑇

几种大肠菌群检测方法的比较

作者:易林

来源:《科技创新与应用》2013年第24期

摘 要:大肠菌群的定义:大肠菌群(coliform group)是指一大群需氧或兼性厌氧、在37℃培养24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群不是细菌学上的分类命名,而是根据卫生学方面的要求,提出的与粪便污染有关的细菌,即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌,这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验,可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌(俗称大肠杆菌)、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群的检验基于它能分解乳糖能产酸产气、革兰氏染色阴性的重要特点。

关键词:大肠菌群;发酵法;平板法;产酸产气

大肠菌群并非细菌学分类命名,而是卫生细菌领域的用语,它不代表某一个或某一属细菌,而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致,其定义为:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠菌群分布较广,在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明,大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方,人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主,而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群数的高低,表明了粪便污染的程度,也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物,其中有健康人粪便,也有肠道患者或带菌者的粪便,所以粪便内除一般正常细菌外,同时也会有一些肠道致病菌存在(如沙门氏菌、志贺氏菌等),因而食品中有粪便污染,则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性,潜伏着食物中毒和流行病的威胁,必须看作对人体健康具有潜在的危险性。

1 大肠菌群检验方法

由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,即:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。

目前国内采用的食品大肠菌群检测方法主要有国家标准《食品卫生微生物学检验 大肠菌群的检验》GB/T4789.3-2003,《食品微生物学检验大肠菌群计数》GB4789.3-2010,《饮用天然矿泉水检验方法》GB/T8538-2008, 《生活饮用水检验方法》GB5750-2006。

加拿大的Sharp AN博士等(1974)首次报道。其基本原理是:以疏水物质在5cm2、孔径为0.45?滋m的滤膜上,横竖各刻印40条线,将滤膜分为1600个小格,以疏水线作为栅栏,防止菌落扩散。样品稀释液首先通过5?滋m的前滤器过滤,再通过0.45?滋m的HGMF滤膜过滤,然后根据所需检验菌的特性,将滤膜置于不同的选择培养基上培养24h~48h,阳性菌落即可通过显色而进行鉴定,如果是大肠菌群则呈蓝色。根据阳性菌落数查“阳性菌落数与单位生长最近似值换算表”即可得出单位样品中大肠菌群的MPN。本法可在24h~30h得出结果,大肠菌群准确率为100%,无假阳性。该法的优点在于:只使用单一的稀释度,大大减少了检验过程中的随机误差和系统误差;在过滤时除掉了所含的一些固体物质,及一些不利于细菌生长的可溶性物质,便于细菌的生长;因为滤膜先在营养琼脂上培养4h~5h,再转移到选择性培养基,使受伤细菌得以恢复,因此缩短了检出时间,提高了灵敏度。

1.4.2 GB5750-2006 滤膜法

用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样,细菌被截留在滤膜上,将滤膜贴在选择性培养基上,经培养后,计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。

(1)过滤水样

用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗糙面向上,贴放在已灭菌的滤床上,固定好滤器,将100mL水浴(如水样含菌数较多,可减少过滤水样量,或将水样稀释)注入滤器中,打开滤器阀门,在负0.5大气压下抽滤。

(2)培养

水样滤完后,再抽气约5s,关上滤器阀门,取下滤器,用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分,移放在品红亚硫酸钠培养基(36.1.3.1)上,滤膜截留细菌面向上,滤膜应与培养基完全贴紧,两者间不得留有气泡,然后将平皿倒置,放入37℃恒温箱内培养22~24h。

(3)观察结果

挑出符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检:(1)紫红色,具有金属光泽的菌落;

(2)深红色,不带或略带金属光泽的菌落;(3)淡红色,中心色较深的菌落。

凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,再接种乳糖蛋白胨培养基液,于37℃培养24h,有产酸产气者,则判定为总大肠菌群阳性。

(4)计算滤膜上生长的总大肠菌群数

总大肠菌群菌落数(CFU/100mL)=水样中的总大肠菌群数报告之(CFU/100mL)/过滤的水样体积(mL)

2 结果与讨论

大肠菌群各检测方法比较表3。

在大肠菌群检测方法中发酵法是传统的检测方法,GB4789.3-2003操作步骤繁杂、干扰因素多,需要操作者有一定的技术和相对丰富的实践经验。消耗的时间和人力较多。适于检测大肠菌群含量较低的样品。GB4789.3-2010第一法MPN计数法步骤少,操作简单,实验现象明显,灵敏度高,是国际上通用的检测方法。适于检测大肠菌群含量较低的样品。但是实验结果的单位是MPN/ml(g),与很多食品标准单位MPN/100ml(g)不一致,使用受到了制约。GB4789.3-2010第二法平板计数法适于检测含量较高的样品,检验结果比较精确。滤膜法对设备的要求较前几种方法高,步骤繁琐,观察结果不方便,计算繁琐。纸片快速检测法的特点在于检测时间短,步骤简单方便,适于需要大量快速的检测机构的检测,成本相对高。传统方法具有原理简单、费用较低、利于推广的优点,因此仍是常规监测中的主要检测方法。 3 结束语

大肠菌群的检验基于它能分解乳糖能产酸产气、革兰氏染色阴性的重要特点,传统的方法都是通过两步或三步的发酵法。原理简单、费用较低,利于推广的优点,因此仍是常规监测中的主要检测方法。消耗的人力和时间较多,对于某些保质期不长的食品来说,影响了企业的生产和销售,对于检测量较大的检验机构来说成本较高。通过实践经验的积累,对以上几种方法的比较后,我认为在实践中可以根据实际情况结合国家标准,灵活采用各种方法进行检验,既能保证实验准确性,也提高效率。

参考文献

[1]张少锋.刘国强.粪大肠菌群检测方法及研究进展[J].海洋通报,2008,27(3),102-106.

[2]高瑞坤.美国环保署的大肠菌群检测技术[J].福建分析测试,2006,

15(2),36.37.

[3]王建龙.PCR技术检测水体中 大肠菌群的研究[J].中国生物工程杂志,2004,24(7),60-64.

[4]王建龙.荧光原位杂交(FISH)技术检测水体中 大肠菌群研究[J].中国生物工程杂志,200424(2),70-73.

作者简介:易林(1975,11-),男,云南广南(籍贯),现职称:工程师,学历:本科,研究方向:微生物检测。

范文四:几种粪大肠菌群检测方法的比较 投稿:夏唆唇

第34卷第3期黑龙江环境通报HeilongjiangEnvironmentalJournal

Vol.34No.3Sep.2010

2010年9月

几种粪大肠菌群检测方法的比较

原刘虹(牡丹江市环境监测中心站黑龙江牡丹江157000)

要:粪大肠菌群作为水体粪便污染的指示菌,其在地表水水质监测评价中具有重要作用。采取精确、快速的粪大肠菌群检测方法,对控制流行疾病的发生和传播有重要的科学意义。为此对应用多管发酵法、滤膜法、快速检测法

(纸片法)、酶底物法检测粪大肠菌群的优缺点作了对比研究。得出了快速检测法(纸片法)、酶底物法有较准确、快速等方法特性,有较好的实用价值。

关键词:粪大肠菌群;检测方法;新技术中图分类号:X830.2文献标识码:A

文章编号:1674-263X(2010)03-0043-03

ComparisonofSeveralTestMethodsofFecalColiforms

MAYuanLIUHong(MuDanJiangEnvironmentMontitoringCenterMuDanJiangHeiLongJiang157000)Abstract:Fecalcoliformsareindexofwaterbodyandhaveimportantfunctioninqualitymonitoringandevalu-ationofsurfacewater.Accurateandfasttestmethodoffecalcoliformsisimportantforepidemicdiseasescon-trol.Wecomparedtestingmethodsoffecalcoliforms,includingmultiple-tubefermentation,membranefilter,rapidpaperstripmethod,enzymesubstratetechnique,foundoutthatrapidpaperstripmethodandenzymesub-stratetechniquewasaccurateandfastandhadhigherpracticalvalue.Keywords:FecalcoliformsTestmethodNewtechnology

前言

粪大肠菌群是水质污染的重要指标之一

〔1〕

1.1.2。

初发酵实验

将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中,在37℃±0.5℃下培养24±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气可轻拍试管,有小气泡升起的为阳性。不明显,1.1.3

复发酵实验

轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管,用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。在44.5℃±0.5℃水浴下培养24±2h。培养后立即观察。发酵管产气表明确信试验阳性。1.1.4

计算和报告结果

根据不同的接种量的发酵管所表现阳性结果的数目,从MPN表中查得相应的MPN指数,计算每升水中粪大肠菌群数的最近似值(mostprobablenumber,MPN)。MPN值=MPN指数×

10(mL)

接种量最大的一管(mL)

对于水源水如湖水、池水和溪水,一旦被粪便污就可能也被肠道病原菌污染而引起肠道传染染,

病甚至流行病,如霍乱、伤寒、细菌性痢疾和阿米巴性痢疾以及脊髓灰质炎和传染性肝炎等病毒疾病。因此精确、快速、可靠的粪大肠菌群检测方法对于准确及时地监测水源水粪大肠菌群的污染状况对有效预报和控制流行疾病的发生与传播有重要意义。11.11.1.1

粪大肠菌群的检测方法多管发酵法原理

〔1〕

多管发酵法是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气并能使乳糖蛋白胨培养液变黄同时产生气泡的原理。

收稿日期:2010-06-04

第一作者简介:马原(1982-),女,大学本科,助理工程师,主要从事生物生态环境监测.

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1.2滤膜法(membranefilter,MF)〔1〕1.2.1

原理

滤膜是一种微孔性滤膜。将水样注入已灭菌的滤器中,经过抽滤,细菌即被截留在膜上,然后将滤膜贴于M-FC培养基上,在44.5℃下进行培养,粪大肠菌群在滤膜上长出具体有特征的菌落,直接计数,通过公式计算每1L水样中含的粪大肠菌群数。1.2.2检测方法1.2.2.1

水样的过滤

用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗糙面向上,贴放于已灭菌的滤床上稳妥地固定好滤器,将100mL水样注入滤器中,加盖,打开滤器阀门,在负压50KPa下进行抽滤。1.2.2.2

培养

水样滤完后,再抽气约5s,关闭滤器阀门。取下滤器,用灭菌镊子夹取带菌滤膜边缘部分移放到M–FC培养基上,滤膜截留细菌面朝上,滤膜应与培养基完全贴紧。盖好平皿,将平皿倒放到44.5℃±0.5℃隔水式培养箱中,培养24±2h。1.2.2.3

计数和报告结果

用肉眼或放大镜观察计数典型菌落数,粪大肠杆菌在M-FC培养基上所产生的菌落是蓝色或蓝绿色,

而非粪大肠杆菌为灰色、淡黄色或无色菌落。正常情况下,由于温度和玫瑰酸盐试剂的选择作用,在M–FC培养基上很少能见到非粪大肠菌群菌落。必要时可将可疑菌落接种于EC培养液,44.5℃±0.5℃培养24±2h,如产气则证明为粪大肠菌群。计数呈蓝色或蓝绿色的菌落,计算出每1L水样中的粪大肠菌群数。

粪大肠菌群菌落数(个/L)=滤膜上生长的粪大肠菌群菌落数×1000/过滤水样量(mL)1.3纸片快速法(rapidpaperstrip)

〔2〕

1.3.1

原理

应用灭菌的滤纸吸收选择性培养基,细菌通过滤纸纤维膨胀而被固定并生长繁殖,粪大肠菌群在发育时伴随产生的琥珀酸脱氢酶将纸片上的红四碳唑(TTC)还原成不可逆的甲膳,产生红色色素,即粪大肠菌在纸片培养基上呈红色菌落,菌落周围产生黄圈是粪大肠菌分解乳糖产酸使指示剂变色的结果。

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1.3.2

检测方法

与发酵法的接种量相同,

接种5张大纸片(纸片的规格是15cm×l0cm),

每张接种10mL水样;接种10张小纸片(纸片的规格是5cm×6cm),其中5张各接种1mL水样,另5张接种1:10稀释水样各1mL。置于45℃培养18~24h,观察结果,根据阳性纸片张数,查MPN值表,报出结果。纸片上出现紫红色菌落,

周围有黄圈者为阳性或出现片状红晕,周围为黄色者亦为阳性。接种纸片培养基时注意水样涂抹均匀。1.4酶底物法(enzymesubstratetechnique,EST)〔3〕

1.4.1

原理

酶底物法采用大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶(β-D-galaetosidase)分解PG(Orthonitro-pheny1β-D-galactopyranoside)使培养液呈黄色,以及大肠埃希氏菌产生葡萄糖醛酸酶(13-glueu-ronidase)分解MUG(4-methY1-umbelllfery-β-D-glucuronide)使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理,来定量分析水样中粪大肠菌群数。1.4.2

检测方法

酶底物法采用51孔定量盘法,此方法是一种基于MPN的方法。检测所需水样为100mL。用100mL的无菌稀释瓶量取100mL水样,加入(2.7±0.5)gMMO-MUG培养基粉末,混摇均匀使之完全溶解,将水样全部倒入5l孔无菌定量盘内,以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡,然后用封口机封口。放入44℃培养箱中培养24h后进行结果判读,将培养24h之后的定量盘取出观察,如果孔穴内的水样变成黄色则表示该孔穴中含有大肠菌群。将定量盘在暗处用波长为366nm的紫外光灯照射,有黄色反应的孔穴如果有蓝色的荧光产生则表示该定量盘孔穴中含有大肠埃希氏菌。计算有黄色反应及有荧光的孔穴数,对照MPN表查出其代表的粪大肠菌群最可能数。2

各检测方法的比较

在粪大肠菌群检测方法中发酵法和滤膜法是传统的检测方法,操作步骤繁杂、干扰因素多,专一性差,需要确认实验,因此检测周期较长,需48

~72h,不适于大量样品的分析。但传统方法具费用较低、利于推广的优点,因此仍有原理简单、

是常规监测中的主要检测方法

〔3〕

酶底物法可以较好地弥补传统方法的不足,该法操作简便,检测时间18~24h或更短,结果无需确认试验,且可以同时检测水中大肠菌可靠,

群和大肠埃希氏菌的污染状况,能够较精确地判断水样的微生物污染状况。并且此种方法已经被世界各国国家及地方实验室和世界各组织机构认可

〔4〕

中国环境监测总站推荐的试用方法《水中总(简称纸片大肠菌群和粪大肠菌群的快速测定》

18~24h与发酵法相比,纸片法只需要45℃,法),

培养即可报告结果,纸片法快速省时简便,适宜污染事故应急监测

〔2〕

表1

各检测方法的比较见表1。

粪大肠菌群各检测方法比较

确认实验需要需要不需要不需要

检测时间48~72h48~72h18~24h18~24h

实验室适用性较准确、较便宜较准确、较便宜较准确、较便宜精确、昂贵

检测方法多管发酵法滤膜法纸片快速检测法

酶底物法

技术难度

易易易难

操作步骤繁琐繁琐简易简易

3结语

本文通过对粪大肠菌群检测方法的综合分析

验证完善过程,需要在验证的过程中不断改进操作细节,使新技术的精确度得到认可。相信在新技术的支持下,精确、快速、可靠、环保、低廉的检测仪器将会研发和得到应用和普及。参考文献:

〔1〕《水和废水监测分析方法》国家环境保护总局编委会.

〔M〕.4版.北京:中国环境科水和废水监测分析方法2002:701-706学出版社,

〔2〕董雪.任羽光.纸片法快速法监测地表水中粪大肠菌

.环境与健康杂志,2003,20(2),119-群的探讨〔J〕120.

〔3〕张少锋.刘国强.粪大肠菌群检测方法及研究进展

〔J〕.海洋通报,2008,27(3),102-106.

〔4〕〔J〕.福建分高瑞坤.美国环保署的大肠菌群检测技术

2006,15(2),36.37.析测试,

〔5〕〔J〕.中王建龙.PCR技术检测水体中大肠菌群的研究

2004,24(7),60-64.国生物工程杂志,

〔6〕王建龙.荧光原位杂交(FISH)技术检测水体中大肠菌

〔J〕.中国生物工程杂志,2004,24(2),70—73群研究

比较,认为快速检测法即纸片法、酶底物法以其操作简便、检测周期短将在未来取代多管发酵法、滤膜法等传统方法,尤其是酶底物法采用密封培养在检测医院污水时可以减少人员接触而降技术,

低检测人员的致病风险,因此具有更强的实用价值和应用价值。并且酶底物法极有可能在近期成为评价水质微生物污染的快速标准检测方法之一。

随着分子生物学的发展及原理的利用,微生物的检测方法发生了质的变化,如仍然处于研究阶段,技术的复杂性和检测费用较高的聚合酶链PCR)式技术(polymerasechainreaction,FISH)

〔6〕

〔5〕

、荧光

原位杂交技术(fluorescentinsituhybridization,

、自动化检测方法(Automatization)、利用

〔5〕

抗体与抗原特异性结合免疫荧光法等目前还不

能广泛用于粪大肠菌群的日常检测。因此要实现实际操作应用与普及还需要经历一个长期的反复

45

范文五:饮用水大肠菌群检测方法 投稿:莫院陣

饮用水大肠菌群检测方法

大肠菌群是指在37℃培养24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革蓝氏阴性无芽孢杆菌的总称。主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成,即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。

水的大肠菌群数是指100 mL水检样内含有的大肠菌群实际数值,以大肠菌群最近似数(MPN)表示。在正常情况下,肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽孢杆菌等多种细菌。这些细菌都可以随人畜排泄物进入水源,由于大肠菌群在肠道内数量多,所以,水源中大肠菌群的数量,是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前,国际上已公认大肠菌群是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。

水中大肠菌群的检测方法,常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可适用于各种水样的检验,但操作繁琐,需要的时间较长。滤膜法仅适用于自来水和深井水,操作简单、快速,但不适用于杂质较多、易于堵塞滤孔的水样。

(一)水样的采集

供细菌学检验的水样,必须按一般无菌操作的基本要求采集,并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4h,在0~4℃下保存不应超过24h ,如不能在4h 内分析,应在检验报告上注明保存时间和条件。

1、自来水取样:应在水龙头打开放水5min,再用无菌容器接取水样,待分析。如水样内含有余氯,则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。

2、江、河、湖、池自然水体取样:可用采样器,采样瓶应先灭菌。采样后,瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样,细菌学分析水样应采在其他样品之前。

(二)初发酵试验

1.水样稀释:制备水样10-1、10-2的稀释液,方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中,充分振荡使混合均匀,并使其中的细菌尽量呈单个存在,即为10-1稀释液;再从10-1制备10-2稀释液。以此类推,稀释到所需倍数。

2.接种和培养:以无菌操作于5支三倍浓缩培养基(接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡)中各加入水样10mL,5支普通培养基试管中加入水样1mL,

5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL, 小心混匀放入37℃培养箱中培养24h 。此即5管法。

3.结果观察:37℃中培养24h后取出观察,观察有无气体(杜汉氏小管内有无气体)和酸产生(培养基有无变色)。在48h之间,培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累,或培养基颜色从紫色变为黄色,便可初步断定为阳性反应。

若所测定的15支管中均为阳性反应,说明浓水样污染严重,可将样品进一步稀释后,再按上述方法接种、培养和观察。

范文六:粪大肠菌群检测方法20110520 投稿:邱揟揠

粪大肠菌群的测定(多管发酵法)

一、 检测限

二、 试剂(均为分析纯)

1、配制单倍乳糖蛋白胨培养液(1份量)(因有固体培养基,以下配置方法仅做参考)

单倍乳糖蛋白胨培养液成分:蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL、碳酸钠10.6g。

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液(1mL):称取溴甲酚紫1.6g倒入小烧杯,用少量95%乙醇溶解,移至100mL容量瓶,用95%乙醇多次洗小烧杯,洗液移入容量瓶,最后用95%乙醇定容至100mL,摇匀备用。(滤纸、100mL小烧杯2只、100mL容量瓶1只、95%乙醇、玻璃棒、药匙、天平、滴管、溴甲酚紫)

碳酸钠(10.6g):称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水,并定容到100mL。(100mL容量瓶1个、100mL小烧杯2只、碳酸钠)

将单倍乳糖蛋白胨培养液成分蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g加热溶解于1000mL蒸馏水中,调节pH为7.2~7.4(用10%碳酸钠调节),再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀,分装于含有倒置的小玻璃管的试管(10mL左右)中,于高压蒸汽灭菌器中,在115℃灭菌20min,贮存于暗处备用(冰箱中可存放3个月)。(>1L锥形瓶1只、1mL移液管1根、pH计、电炉、倒置的小玻璃管的试管60套(小试管(12x150mm )+小套管(杜氏小管)(约 6mm × 36mm ))、高压蒸汽灭菌器、试管架(10只入)、纱布和棉花) 2、三倍配制单倍乳糖蛋白胨培养液:制法同上,除蒸馏水外,其余配方比例三倍。

3、EC培养液(1份量)

将EC培养液所需成分胰胨20g、乳糖5g、胆盐三号1.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)4g、磷酸二氢钾(KH2PO4)1.5g、氯化钠5g,加热溶解于1L烧杯中,然后分装于含有玻璃倒管的试管中。用10%Na2CO3调节pH以防止培养基灭菌后pH上升0.2左右(确定值需要前期在实验室寻找规律)。再将分装试管置高压蒸汽灭菌器中,115℃灭菌20min。灭菌后pH应为6.9。(>1L烧杯1只)

在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处,存放时应避免阳光直接照射,并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养基颜色变化,或体积明显变化时废弃不用。

三、耗材和仪器

1、仪器:高压蒸汽灭菌器、生化培养箱(恒温箱)(25-44℃)、无菌操作台、天平 2耗材:倒置的小玻璃管的试管70套(小试管(12x150mm)+小套管(杜氏小管)(约 6mm × 36mm ));与小试管配套的棉塞或纱布和棉花;药匙、电炉、3mm接种环3根、吸耳球、牛皮纸、酒精灯1个、火柴、镊子2个、笔、试管架、滤纸(1盒)、、1mL及10mL移液管各2支

三、实验步骤 1、 水样接种量

将水样充分混匀后,根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管(平行)。

(如接种体积为10mL,则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL;如接种量为1ml或少于1mL,则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中) 2、 初发酵试验

将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管(含有玻璃倒管的试管)中(取原水样1mL,加如到9mL无菌生理盐水中混匀。这时候得到的稀释液1mL就相当与0.1mL,

再按这个方法再稀释一次,就可以得到1mL相当于0.01ml的稀释液了。这时候取1mL加入发酵管中即可)。在37℃±0.5℃下培养24h±2h(箱内温度一定要达到所要求的温度(37.5±0.5℃)时,方可放入,下同)。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。(培养液中加入溴甲酚紫作为酸度指示剂,细菌产酸后,培养液即由原来的紫色变成黄色。)产酸产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显,可轻拍试管,有小气泡升起的为阳性。(需20支同规格试管)

3、 复发酵试验

轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管,用3mm接种环或灭菌棒(2-3环)将培养物转接到EC培养液中。在44.5℃±0.5℃下培养24h±2h(水浴箱的水面应高于试管中培养基液面,提高培养温度可造成不利于来自自然环境的大肠菌群的生长)。接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中。培养后立即观察,发酵管产气则证实为菌群阳性。

记录:复发酵阳性管数

Ps:接种过程(亦有参考视频可供学习)

① 接种前的准备工作。

a.检查接种工具,进行环境消毒。

b.在欲接种的培养基试管上贴好标签,标上接种的菌名、操作者、接种日期等。 c

.将培养基、接种工具和其他用品全部放在实验台上摆好,进行环境消毒。 ② 接种方法

接种方法: 斜面接种

将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列,挟于左手的拇指与其他四指之间,用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。

置试管口于酒精火焰附近。

将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红,再横过火焰3次,然后再放入有菌试管内,在管壁上停留片刻待其冷却。

取少许菌种置于另一支试管中,按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。取出接种工具,试管口和棉塞进行火焰灭菌。

重新塞上棉塞。烧死接种工具上的残余菌,把试管和接种工具放回原处。

4、 计算(参考HJ/T 347-2007)

其他问题:

1、样品的保存 : 采样用的容器使用前应盖好瓶盖,用牛皮纸将瓶盖和瓶颈处包裹好,置干燥箱160℃-170℃干热灭菌2h,或用高压蒸汽灭菌器121℃灭菌15min。采样后水样的正确保存也很重要,如保存不当可使样品中的大肠菌群细菌死亡或在一定条件下再生长,这些都将影响检测结果的准确性。检测室接到水样后,应立即检测,如因故不能检测时,应立即将样品置于冰箱内(2℃-10℃)并于2小时内检测。

2、多管发酵法所用的发酵管、小玻璃倒管和塑料盖可在清洗、高压灭菌和紫外线消毒后重复使用

范文七:大肠杆菌群检测方法 投稿:史脺脻

大肠杆菌群检测

方法:

用平板涂布法将样品稀释后(每个水样做3个浓度)涂布到伊红美蓝培养基后,待长出菌落,观察符合特征的群落,计算菌落数目,从而求出总数目。

{培养基及试剂配制}------伊红美蓝培养基 1. 成分:

蛋白胨 10g

乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 琼脂 20~30g 蒸馏水 1000ml 2%伊红水溶液 20ml 0.5 %美蓝水溶液 13ml

2. 配制方法:

先将琼脂加至900ml蒸馏水,加热溶解,然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨,混匀使之溶解,再以蒸馏水补足至1000ml,调整PH为7.2~7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤,再加入乳糖,混匀后定量分装于烧瓶内,置高压蒸汽灭菌器内以115℃灭菌20min,冷却备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂,冷至50~55℃,加入伊红和美蓝溶液,摇匀,倾注平板。

1.称量

按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮,在称取时动作要迅速。另外,称药品时严防药品混杂,一把牛角匙用于一种药品,或称取一种药品后,洗净、擦干,再称取另一药品,瓶盖也不要盖错。

2.溶化

在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基,将称好的琼脂放入已溶化的药品中,再加热溶化,在琼脂溶化的过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。

3.调pH

在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值,如果pH偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH值,直至pH达7.6。反之,则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头,以避免回调,否则,将会影响培养基内各离子的浓度。

对于有些要求pH值较精确的微生物,其pH的调节可用酸度计进行(使用方法,可参考有关说明书)。 4.分装

按实验要求,可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染。液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。

{实验步骤}

1. 涂布平板法:

1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。

2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。

3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 4.将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀,每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至长出菌落后即可计数。

2. 菌落统计方法-----平板选择法

1.细菌常选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落计数标准。每一稀释度采用两个平板菌落的平均数,如两个平板其中一个有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长平板作为该稀释度的菌落数,如片状菌落不到平板的一半,而另一半菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘2以代表全板菌落数。

2.计数方法

作平板菌落计数时,一般无用肉眼观察,用钢笔或蜡笔在平板上进行点数,必要时可借助于放大镜检查有无遗漏的微小菌落。在计数出各平板菌落数后,求出同一稀释度菌落的平均数。

表1 平板上菌落数对应的标准差

平板上菌落数(个/皿)

30≤x≤50

51≤ x≤99

100≤x≤300

10.0 20.0 50.0 标准差(±)

如三个重复分别为43、32、46,则平均值为40.3,(x-x)2分别为72.9、68.89、32.49,δ=±

7.37,写成±7.4(一)。

将检验所得的标准差作修约处理,与标准规定的允许误差作比较,只要越出规定的极限数值都判定为不符合标准要求,示例见表2。

表2 菌数的测定误差与判定示例

稀释平

检测中

平板菌落数测定值(个/皿)

标准差

板菌落数 允许的误差 (个/皿)

n-1

是否符 合要求 符合 符合 不符 不符

重复1 重复2 重复3 平均值

n-1

)

)

42 40 40 37 61 57

61 60 60 63 86 55

47 50 51 50 82 49

50.0 50.0 50.3 50.0 76.3 53.7

±0.0(-) ±10.0 ±0.0(+) ±13.0

30 ≤x≤50 ±10.0

51≤x≤99 ±20.0

±3.4(+) 符合 ±4.2(-) 符合

90 91 108

100≤x≤300 ±50.0

298 297 300

3 菌落计数

63 59 95 206 206 174

102 105 123 286 287 286

85.0 85.0 108.7 263.3 263.3 253.3

±0.0(-) 符合 ±3.6(-) 不符 ±4.0(+) 符合 ±0.0(+) 不符 ±0.0(-) 符合 ±9.1(-) 不符

①应选择平均菌落数在30~300之间的稀释度,乘以稀释倍数报告;②如有两个稀释度,其生长的菌落数均在30~300之间,视两稀释液测定值之比来决定,如其比值小于2,应报告其平均数;如大于2,则报告其中较小的数字;③如所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告;④如所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告;⑤如所有稀释度均无菌落生长,则以小于①乘以最低稀释倍数报告;⑥如所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间,其中一部分大于300或小于30时,则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

按下列公式进行计算cfu:

每毫升中菌落形成单位(cfu) =同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5

范文八:大肠菌群检测方法 投稿:魏菐菑

大肠菌群检测方法

一、 器皿及药品

试管:Ø 10×100mm(或者其它规格),按每种样品接种5个平行样计算所需试管的数目。

小导管:每一根试管配一根小导管

试管塞:同试管配套,能耐130度的高温。

烧杯:250ml,每种样品一个,1000 ml 3个以上

吸液管:5 ml,每种样品一支。

量筒:200 ml一支

试管架:一个,孔目与所需试管数目一致。

三角瓶:按所需总体积制备2个

药品:乳糖胆盐发酵管

NACL:生理盐水0.82%的浓度。

天平一台(0-100g)或者其它规格

二、 试样的制备及药品的配制

(1)乳糖胆盐发酵管配制:按试管的数目及每试管的体积50 ml。算

出所需试管的总数及体积,按3.6%浓度称取乳糖胆盐发酵管的重量,放入三角瓶中,加入所需的体积的水。加热搅拌均匀,使其完全溶解。

(2)生理盐水的配制:根据所需总体积,(每种样品200ml)按0.82%

的浓度称取NACL的重量,并到入三角瓶中,加入所需的体积

的水,加热搅拌均匀使其完全溶解,用棉团塞紧,并用纸包好瓶口,以备灭菌

三、试验步骤

(1)轻轻从试管壁放入小导管,将乳糖胆盐发酵管溶液到入试管内,

管内不能产生气泡,每管50 ml,导管用试管塞塞紧,放入大烧杯并用压力锅灭菌。将所需250ml烧杯、量筒、吸液管、已配好的生理盐水全部灭菌。

(2)在灭菌前先将无菌室的灭菌两小时以上,将以上灭菌好的器皿

及药品移入灭菌好的工作台上(无菌室内)冷却。

(3)检验员将采好的样品及医用手套放入无菌室的送样口内。

(4)检验员带上口罩进入无菌室,带上手套,准确称取10 ±1g每

个样品,剪碎后分别入已灭菌250 ml烧杯中,并作好记号以便识别,加入已冷却200 ml生理盐水,充分混匀。

(5)用吸液管吸取以上生理盐水样液5 ml,加入50 ml乳糖胆盐发

酵管试管内,每种样品做5个平行样,将所有加入样液的试管置35℃±2℃的培养箱,培养24小时后观察,如不产酸也不产气,则报告为大肠菌群阴性。如产生气,则按《一次性使用卫生用品卫生标准》大肠菌群检测方法继续检测。

山东恒安纸业有限公司

质管部

2005年7月

范文九:大肠菌群介绍与检测方法 投稿:徐荊荋

大肠菌群介绍与检测方法

作者:佚名 来源:生物秀 时间:2007-10-12

一、大肠菌群介绍

大肠菌群并非细菌学分类命名,而是卫生细菌领域的用语,它不代表某一个或某一属细菌,而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致,其定义为:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠菌群分布较广,在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明,大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方,人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主,而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。

大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的,主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低,表明了粪便污染的程度,也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物,其中有健康人粪便,也有肠道患者或带菌者的粪便,所以粪便内除一般正常细菌外,同时也会有一些肠道致病菌存在(如沙门氏菌、志贺氏菌等),因而食品中有粪便污染,则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性,潜伏着食物中毒和流行病的威胁,必须看作对人体健康具有潜在的危险性。

大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一,目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。

二、检验方法:

由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,即:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。

目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。

(一)国家标准:国家标准采用三步法,即:乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验:样品稀释后,选择三个稀释度,每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h,观察是否产气。

分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上,36±1℃培养18-24h,观

察菌落形态。

证实试验:挑取平板上的可疑菌落,进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h,观察产气情况。

报告:根据证实为大肠杆菌阳性的管数,查MPN表,报告每100ml(g)大肠菌群的MPN值。

具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》

(二)原国家商检局制订的行业标准,等效采用美国FDA的标准方法,用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法:

推测试验:样品稀释后,选择三个稀释度,每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h,观察是否产气。

证实试验:将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中,36±1℃培养48±2h,观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表,报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。

具体操作参见 SN0169-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》

三、说明:

1.MPN检索表:

MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法,对样品进行连续系列进行稀释,加入培养基进行培养,从规定的反应呈阳性管数的出现率,用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。

MPN检索表只给了三个稀释度,如改用不同的稀释度,则表内数字应相应降低或增加10倍。注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的,而且结果报告单位也不相同。

2.初发酵和证实试验:

无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法,都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验,培养基的配制略有不同,但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义,即“在37℃分解乳糖产酸产气”。

初发酵阳性管,不能肯定就是大肠菌群细菌,经过证实试验后,有时可能成为阴性。有数据表明,食品中大肠菌群检验步骤的符合率,初发酵与证实试验相差较大。因此,在实际

检测工作中,证实试验是必需的。

3.产气量与倒管:

在乳糖发酵试验工作中,经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡(有时比小米粒还小),有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明,大肠菌群的产气量,多者可以使发酵倒管全部充满气体,少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时,可以用手轻轻打动试管,如有气泡沿管壁上浮,即应考虑可能有气体产生,而应作进一步试验。

4.挑选菌落:

国家标准中,需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离,对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称,在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样,而且与大肠菌群的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基,在该平板上,大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时,检出率最高;红色、粉红色菌落检出率较低。

另外,挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系,只挑取一个菌落,由于机率问题,尤其当菌落不典型时,很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落,如无典型菌落则应多挑几个,以免出现假阴性。

5.抑菌剂:

大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌,特别是革兰氏阳性菌的生长。

国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂,行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂,BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。

抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌,而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选,但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微,称量时稍有误差,即可对抑菌作用产生影响,因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。

范文十:大肠菌群的检测方法 投稿:谭葀葁

大肠菌群的检测方法

(日本方法) 日本方法)

本标准适用于出口食品中大肠菌群的检验。 本标准适用于出口食品中大肠菌群的检验。 本标准等同采用日本标准。 本标准等同采用日本标准。 1. 设备和材料 ⑴吸管:1ml,具有 0.1ml 刻度;5ml 和 10ml,具 1ml 刻度。 ⑵培养箱:36±1℃。 ⑶均质器。 ⑷天平:感量 0.1g。 ⑸显微镜。 ⑹菌落计数器。 ⑺冰箱:0~5℃和-15~20℃。 ⑻微波炉。 2.培养基和试剂 ⑴去氧胆酸盐琼脂(DC) 。 ⑵75%乙醇。 ⑶稀释剂:灭菌生理盐水(0.85%) 。 ⑷革兰氏染色液。 3.样品制备 ⑴以无菌操作采取有代表性的样品。如有包装,则用 75%乙醇在开口处擦试 后取样, 如不能及时检测, 应将冷冻品置于-15℃保存; 非冷冻易腐的食品, 应置于 4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于 2~5℃18 小时解冻,或在 45℃ 以下 15 分钟内解冻。 ⑵ 不同食品样品匀液的制备: ①液体食品 以无菌吸管取样 25 毫升放入盛有 225 毫升稀释剂的灭菌玻璃瓶内, (瓶 内预置适当数量的玻璃珠) ,以 30cm 幅度,于 7 秒内振摇 25 次(或以机械振荡 器振摇) ,制成 1:10 的样品匀液。 ②固体或半固体食品,以无菌操作取 25 克样品,放入装有 225 毫升稀释剂

的灭菌均质杯内,于 8000r/min 均质 1~2 分钟,制成 1:10 的样品匀液。如样 品均质时间超过 2 分钟,应在均质杯外加冰水冷却。 ③稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计, 用稀释剂将样品匀液制成一系 列十倍递增的样品稀释液,如 10-2、10-3、10-4……。从制备样品匀液至稀释完毕, 全过程不得超过 15 分钟。 ⑶平板接种 ①对于每一样品,选用合适的三个连续稀释度的样品液进行计数。 ②分别用灭菌吸管吸取 1 毫升样品液放入作了适宜标志的灭菌平皿内。每 个样品用两个平皿。 ③分别加 12~15 毫升去氧胆酸盐琼脂(45±1℃)到各平皿内。立即将平 皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。混合方法是将平皿倾斜和旋转。要防 止把混合物溅到平皿壁和盖上。凝固后于其表面再覆盖一薄层培养基,同时 将去氧胆酸盐琼脂倾注到空白平皿作空白对照。 ④培养:待琼脂凝固后将平皿翻转,立即放入 36±1℃的恒温培养箱内, 培养 24±2 小时。 ⑤菌落计数和记录:培养后,立即数每个平板上的典型菌落数。 (菌落特 征:直径 0.5 毫米以上的明显的紫红色菌落,菌落周围有红色的胆汁沉淀环) 。 ⒋结果报告 报告每克(毫升)样品中的大肠菌群菌落数。 附录 A 培养基和试剂 (补充件) A1 去氧胆酸盐琼脂 蛋白胨 乳糖 去氧胆酸钠 磷酸氢二钾 柠檬酸铁铵 中性红 10.0g 10.0g 1.0g 2.0g 2.0g 0.033g

琼脂 氯化

钠 蒸馏水

15.0g 5.0g 1000ml

将各成分加于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,冷却至 50℃备用。 *勿过分加热,勿高压灭菌。

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