酶活力测定_范文大全

酶活力测定

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【专家解析】酶活力测定

【优秀范文】酶活力测定

范文一:酶活力测定 投稿:姚璚璛

胰蛋白酶和木瓜蛋白酶活力测定

(1)胰蛋白酶活力的测定:将1.0mL胰蛋白酶底物溶液与1.0mL硼酸盐 缓冲液混合。调温至25℃、调pH至8.0后加入0.05mL胰酶溶液,用浓度为0.10mol/L的NaOH溶液滴定,使其pH值稳定在7.9~8.0范围内。反应8min时读取NaOH溶液的消耗量(uL),以每分钟水解1.0umol/L BAEE所需的酶量定义为一个胰蛋白酶活力单位。

胰蛋白酶活力(U·g-1)=V×0.10×1000/(m×8)

式中,V为NaOH溶液的消耗量(uL),0.10为NaOH溶液浓度(mol·L-1),m为0.05mL酶液的酶量(mg)。

(2)木瓜蛋白酶活力的测定:将5.0mL木瓜蛋白酶的激活液和5.0mL 底物溶液混合,调温至25℃后加入0.lmL木瓜蛋白酶溶液,用浓度为 0.02mol·L-1的NaOH溶液滴定,使其pH恒定在7.0左右。反应5min时读取NaOH溶液的消耗量(uL),在上述条件下每分钟水解1.0 umol BAEE所需的酶量定义为一个木瓜蛋白酶活力单位。

木瓜蛋白酶活力(U·g-1)=V×0.02×1000/(m×5)

式中,V为NaOH溶液的消耗量(uL),0.02为NaOH溶液浓度(mol·L-1),m为0.lmL酶液的酶量(mg)。

范文二:酶活力的测定 投稿:秦珩珪

实验十八 淀粉酶活力的测定

一、目的

学习和掌握测定淀粉酶(包括α-淀粉酶和β-淀粉酶)活力的原理和方法。 二、原理

淀粉是植物最主要的贮藏多糖,也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解,每次水解下一分子麦芽糖,又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原,生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸,其反应如下:

淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线,用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 淀粉酶存在于几乎所有植物中,特别是萌发后的禾谷类种子,淀粉酶活力最强,其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同,α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热,在70℃15min钝化。根据它们的这种特性,在测定活力时钝化其中之一,就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶,测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力(α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力),再减去α-淀粉酶的活力,就可求出β-淀粉酶的活力。

三、实验材料、主要仪器和试剂 1.实验材料

萌发的小麦种子(芽长约1cm) 2.仪器 (1)离心机 (2)离心管 (3)研钵 (4)电炉

(5)容量瓶:50mL×1, 100mL×1 (6)恒温水浴

(7)20mL具塞刻度试管×13 (8)试管架

(9)刻度吸管:2mL×3, 1mL×2, 10mL×1 (10)分光光度计

3.试剂(均为分析纯)

(1)标准麦芽糖溶液(1mg/mL):精确称取100mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100mL。 (2)3,5-二硝基水杨酸试剂:精确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中,加入50mL蒸馏水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞,勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。

(3)0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液

A液:(0.1mol/L 柠檬酸):称取C6H8O7·H2O 21.01g,用蒸馏水溶解并定容至1L。 B液:(0.1mol/L柠檬酸钠):称取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g,用蒸馏水溶解并定容至1L。 取A液55mL与B液145mL混匀,既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。 (4)1%淀粉溶液:称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 四、操作步骤

1.麦芽糖标准曲线的制作

取7支干净的具塞刻度试管,编号,按表1加入试剂: 表1 麦芽糖标准曲线制作

管 号

4 1.0 1.0 1.0 2.0

试 剂

麦芽糖标准液(mL)

蒸馏水(mL) 麦芽糖含量(mg) 3,5-二硝基水杨酸(mL) 1

0 2.0 0 2.0 2 0.2 1.8 0.2 2.0 3 0.6 1.4 0.6 2.0 5 1.4 0.6 1.4 2.0 6 1.8 0.2 1.8 2.0 7 2.0 0 2.0 2.0

摇匀,置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点,在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线。

2.淀粉酶液的制备

称取1g萌发3天的小麦种子(芽长约1cm),置于研钵中,加入少量石英砂和2mL蒸馏水,研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中,用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15~20min,每隔数分钟搅动1次,使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min,将上清液倒入100mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液,用于α-淀粉酶活力测定。

吸取上述淀粉酶原液10mL,放入50mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于淀粉酶总活力的测定。

2. 酶活力的测定:取6支干净的试管,编号,按表2进行操作。

表2 酶活力测定取样表

操 作 项 目 α-淀粉酶活力测定 β-淀粉酶活力测定 Ⅰ- 1 Ⅰ- 2 Ⅰ- 3 Ⅱ- 4 Ⅱ- 5 Ⅱ- 6

淀粉酶原液(mL) 1.0 1.0 1.0 0 0 0 钝化β-淀粉酶 置70℃水浴15min,冷却

淀粉酶稀释液(mL) 0 0 0 1.0 1.0 1.0 3,5-二硝基水杨酸(mL) 2.0 0 0 2.0 0. 0 预保温 将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min 1%淀粉溶液(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 保温 在40℃恒温水浴中准确保温5min

3,5-二硝基水杨酸(mL) 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0 将各试管摇匀,显色后进行比色测定光密度,记录测定结果,操作同标准曲线。

五、结果计算

计算Ⅰ- 2、Ⅰ- 3光密度平均值与Ⅰ- 1光密度之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(mg),按下列公式计算α- 淀粉酶的活力。

计算Ⅱ- 2、Ⅱ- 3光密度平均值与Ⅱ- 1光密度之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(mg),按下式计算(α+β)淀粉酶总活力。

β-淀粉酶活力=(α+β)淀粉酶总活力-α-淀粉酶活力

六、附 注

(1)样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。

(2)为了确保酶促反应时间的准确性,在进行保温这一步骤时,可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴,准确记录时间,到达5min时取出试管,立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应,以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过±0.5℃。

(3)如果条件允许,各实验小组可采用不同材料,例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子,比较测定结果,以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。

七、思考题

1.为什么要将Ⅰ- 1、Ⅰ- 2、Ⅰ- 3号试管中的淀粉酶原液置70℃水浴中保温15min? 2.为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别置于40℃水浴中保温? 参考答案

1.由于β-淀粉酶不耐热,70℃15min被钝化,所以将此3个试管中的溶液在70℃保温15min使其钝化,从而测得的淀粉酶活性即为α-淀粉酶活性。

2.酶反应需要适当的温度,只有在一定的温度条件下才表现出最大活性,40℃是淀粉酶的最适温度,所以应将酶液和底物(淀粉液)先分别保温至最适温度,然后再进行酶反应,这样才能使测得的数据更加准确。

(唐 咏)

http://www.scuta.edu.cn/yuanxi/bylw/syzd/srdsyzdsy18.htm

实验五 双缩脲法测定蛋白质含量(考核实验) 一、 教学目的与要求:

① 加强对蛋白质的有关性质的认识;

②掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法; ③对学生所学进行综合的测试。 二、 教学实验原理:

蛋白质含有两个以上的肽键,因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu形成紫红色络合物,其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量氨基酸成分无关,因此利用此进行比色测定蛋白质含量。

在一定条件下,未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应,并于540—560nm下比色,可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度,标准蛋白溶液可以用结晶的牛(或人)血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。

除-CONH-有此反应外,-CONH2-,-CH2-,NH2-,-CS-CS-NH2,等基团亦有此反应。

三、 考核主要内容

1、 标准曲线的制作

取6支干净的试管,按0→5编号,然后按下表依次加入试剂,充分混匀,在室温下放置半小时,以管为空白,在550nm波长处测定消光值(OD),以各管蛋白质含量(毫克)横坐标,OD值为坐标,画出标线。

2+

2、 样品测定:取样品液1.0 ml,同法进行,测其OD值,对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。 3、 分光光度计的使用:规定每组在10min以内全部完成操作(共测6支管);同时注意操作是否

规范。 4、 成绩的计算:此次的实验占30%(包括平时的表现及实验报告的完成情况和完成质量),平时的

五次实验共占70%,每次实验按总分为5分为满分进行打分,总评折合成百分制。 四、 实验注意事项:

① 标准样品的浓度为:10μg/ml;

② 实验过程中不得过问他人,同组人可以配合进行;

③ 实验报告在课堂上独立完成,同组人数据相同,不得抄袭他人数据,一旦发现以零

分处理; ④ 实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做;

⑤ 对实验结果进行简单的分析。

http://www.scuta.edu.cn/yuanxi/bylw/syzd/syzdsy5.htm

3.5 氨基酸态氮的测定(酸度计法)

开始操作同总酸的测定,然后加入甲醛10ml,摇匀,继续用0.0500N氢氧化钠标准溶 液滴定至PH9.2,记下加入甲醛后耗用0.0500N氢氧化钠标准溶液毫升数V。 用同一条件做一空白对照,记下耗用数V0。 按式(6)计算:

(V-V0)×N×0.014

氨基酸态氮(g/100g)= ━━━━━━━━━━×100 .......................(6) W 10×━━ S

式中:V——样品加入甲醛后,耗用0.0500氢氧化钠标准溶液毫升数; V0——空白加入甲醛后,耗用0.0500N氢氧化钠标准溶液毫升数; N——氢氧化钠标准溶液当量浓度; 0.014——氮的毫克当量; W——样品重量;

S——样品稀释液体积,ml。

http://www.foodmate.net/cgi-bin/topic.cgi?forum=12&topic=627&show=0

2.8.4 氨基酸态氮测定(酸度计法)

2.8.4.1 氨基酸是蛋白质分解出来的产物,酱油中氨基酸有18种,其中以谷氨酸占比例最多。因此氨基酸态氮的含量高低可表示鲜味的程度,是决定酱油质量及营养价值的重要指标。一般含量在0.4——0.8%之间。当酱油掺伪时,氨基酸态氮含量明显降低。伪造酱油中根本不含氨基酸态氮。

2.8.4.2 原理 利用氨基酸的两性作用,加甲醛固定氨基的碱性,使羧基的酸性显示,用氢氧化钠标准溶液滴定后定量,以酸度计测定终点。

2.8.4.3 试剂是36%甲醛溶液;0.05N氢氧化钠标准溶液。 2.8.4.4 仪器 酸度计;磁力搅拌器;微量滴定管。

2.8.4.5 操作 取样品5.0ml,置于100ml容量瓶中,加水至刻度,混匀后吸取20.0ml置于200ml烧杯中,加水60ml,开动磁力搅拌器,用0.05N氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示PH8.2时加入10.0ml甲醛溶液,混匀后继续滴定至PH9.2,记下消耗0.05N氢氧化钠标准溶液的ml数。同时取水80ml做试剂空白试验。

(V1—V2)×N×0.014

X= ——————————×100 5×V3 100

X-样品中氨基酸态氮含量,g/100ml。

V1-测定用样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积,ml。 V2-试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积,ml。 V3-样品稀释液取用量,ml。 N-氢氧化钠标准溶液的当量浓度。

0.14-1ml1N氢氧化钠标准溶液相当氮的数。

2.8.4.6 判断 如酱油中氨基酸态氮低于正常值,可认为酿造酱油中掺入水或盐水。如氨基酸态氮检不出,可能是伪造酱油。

http://shyux.go.nease.net/ziliao/jiancff/jiancc.htm

氨基态氮测定

中国食品产业网 (2004年10月30日09:55)

5.20.1 原理:

氨基酸为两性电解质。在接近中性的水溶液中,全部解离为双极离子。

当甲醛溶液加入后,与中性的氨基酸中的非解离型氨基反应,生成单羟

甲基和二羟甲基诱导体。此反应完全定量进行。此时放出氢离子可用标

准碱液滴定。根据碱液的消耗量,计算出氨基态氮的含量。

5.20.2 试剂:

所用试剂均为分析纯,使用的水为蒸馏水或同等纯度的水。

5.20.2.1 0.1MOL/L 氢氧化钠标准溶液:按GB601配制与标定。

5.20.2.2 0.05MOL/L 氢氧化钠标准滴定溶液:用0.1MOL/L的氢氧化钠标准溶

液当天稀释。

5.20.2.3 中性甲醛溶液:量取200ML甲醛溶液(GB685)于400ML烧杯中,置

于电磁搅拌器上,边搅拌边用0.05MOL/L氢氧化钠溶液调至PH8.1。

5.20.2.4 30%过氧化氢(HG3-1082)

5.20.2.5 PH7.00、4.01缓冲溶液。

5.20.3 仪器设备:

实验室常用玻璃仪器及下列各项:

5.20.3.1 PH计:直接读数,测量范围0-14PH,精度±0.1PH。

5.20.3.2 电磁搅拌器。

5.20.3.3 玻璃电极

5.20.4 试样的制备:

5.20.4.1 浓缩果蔬汁

在浓缩果蔬汁中,加入与在浓缩过程中失去的天然水分等量的水,使

其成为果汁,并充分混匀,供测试用。

5.20.4.2 果蔬原汁及果蔬汁饮料

将试样充分混匀,直接测定。

5.20.5 测定步骤:

5.20.5.1 PH计校正:按W-PBB-4303中“PH值测定作业规范”校正步骤校正。

5.20.5.2 吸取试样M克(毫升)(氨基态氮的含量为1-5毫克)于烧杯中,加5滴

30%过氧化氢,将烧杯置于电磁搅拌器上,电极插入烧杯内试样中适当

位置。如需要加适量蒸馏水。

5.20.5.3 开动电磁搅拌器,先用0.1MOL/L氢氧化钠溶液慢慢中和试样中的有机

酸。当PH达到7.5左右时,再用0.05MOL/L氢氧化钠溶液调至PH8.1,

并保持1分钟不变。然后慢慢加入10-15ML中性甲醛溶液。1分钟后

用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至PH8.1。记录消耗0.05MOL/L氢氧化

钠标准滴定溶液的毫升数。

5.20.6 结果表示:

-------------------------------------------------------------------------------- 测定结果表示见公式: X=

X:每100克(或100毫升)试样中氨基态氮的毫克数,(mg/100g或

mg/100ml)

C:氢氧化钠标准滴定溶液的浓度,MOL/L

V:加入中性甲醛溶液后,滴定试样消耗0.05MOL/L氢氧化钠标准滴定溶

液的体积,ML

M:试样的重量,G(或体积ML)

K:稀释倍数

14:1ML1N氢氧化钠标准滴定溶液相当于氮的毫克数

同一样品以两次测定结果的算术平均值作为结果,精确到小数点后第一位。 http://mzr3228.foodqs.com/news/spsb03/2004103095527.htm

范文三:酶活力测定 投稿:韩礴礵

华南农业大学 综合实验报告

实验项目名称:食品发酵工业中常用系列酶活力测定 实验项目性质:综合性实验 计 划 学 时 :6

所属课程名称:食品与发酵工业分析 班 级:09生物工程2班 姓 名:叶思婕 学 号:200930620124 实验课指导老师:沈玉栋

摘 要

测定食品发酵工业中常用酶活力,对于选择酶种类,工艺条件的制定等有重

要意义。本次实验中对工业常用系列酶——糖化酶,淀粉酶,蛋白酶进行了酶活力测定。其中,测定糖化酶采用直接滴定法,测定淀粉酶采用目测比色法,测定蛋白酶采用福林酚法。

关键词:酶活力 糖化酶 淀粉酶 蛋白酶 直接滴定法 目测比色法 福林酚法

1 前言

酶,从早期的酿造、发酵食品开始,至今已广泛应用到各种食品上。随着生物科技进展,不断研究、开发出新的酶制剂,已成为当今新的食品原料开发、品质改良、工艺改造的重要环节。目前已有几十种酶成功地用于食品工业。例如,葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品的品质与风味等。应用的酶制剂主要有:淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶等。

酶作为生物体内的一种具有催化活性的蛋白质,生物体内几乎所有的反应都离不开没的催化。作为生物体内的催化剂,催化效率——即酶的活力是酶的一个重要的的指标。酶活力的大小可用在一定条件下,酶催化某一化学反应的速度来表示,酶催化反应速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中,底物往往是过量的,测定初速度时,底物减少量占总量的极少部分,不易准确检测,而产物则是从无到有,只要测定方法灵敏,就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。

糖化酶,又称葡萄糖淀粉酶、γ-淀粉酶。它能把淀粉从非还原性未端水介a-1,4葡萄糖苷键产生葡萄糖,也能缓慢水解a-1,6葡萄糖苷键,转化为葡萄糖。同时也能水解糊精,糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。采用可溶性淀粉为底物,在一定的pH值与温度下,使之水解为葡萄糖 (还原糖),以直接滴定法测定。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称,通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料。淀粉酶的种类很多,根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶与β-淀粉酶。液化型淀粉酶(又称-1,4糊精酶,俗称-淀粉酶)能水解淀粉中-1,4葡萄糖苷键,水解淀粉为分子量不一的糊精,淀粉迅速被液化。使淀粉与碘呈蓝紫色特征反应逐渐消,以该颜色的消失速度计算酶的活力的高低。 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称,广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶,主要由霉菌、细菌,其次由酵母、放线菌生产。 福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物),由

于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等),可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。

通常以酪蛋白为底物,在一定pH值和温度条件下,同酶液反应,经一段时间后终止酶促反应,经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液,用Na2CO3碱化,再加入福林-酚试剂显色,蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比; 酪氨酸含量用分光光度计在680nm波长处测定,从而计算出蛋白酶的活力。

2 实验材料和仪器

2.1 实验材料

碱性酒石酸铜甲溶液、0.1%标准葡萄糖溶液、pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液、0.1mol/L氢氧化钠溶液、2%可溶性淀粉溶液、固体曲、稀碘液、2%可溶性淀粉溶液、0.02mol/L pH6.0的磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液、标准终点比色液、液化型淀粉酶粉(即α-淀粉酶粉)、福林酚试剂、0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液、标准酪氨酸溶液(50μg/mL)、酪蛋白溶液(0.5%)。 2.2 实验仪器

滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶、试管 、三角瓶、滴管、移液管、恒温水浴、白瓷板、纱布、恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。

3 实验步骤

3.1 糖化酶活力测定

3.1.1 5%固体曲浸出液制备:称取5.0g固体曲(以绝干曲计),置于250mL烧杯中,加90mL水和10mL pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液,搅匀,于30℃水浴中保温浸1小时,每隔15min搅拌一次。用脱脂棉过滤,滤液为5%固体曲浸出液。

3.1.2 固体曲糖化液的制备:吸取25mL 2%可溶性淀粉溶液,置于50mL容量瓶中,于30℃水浴预热10min。准确加入5mL 5%固体曲浸出液,摇匀,立即记下时间。于30℃水浴准确保温糖化1小时。迅速加入15mL 0.1mol/L氢氧化钠

溶液,终止酶解反应。冷却至室温,用水定容至刻度。

同时作一空白液:吸取25mL 2%可溶性淀粉溶液,置于50mL容量瓶中,先加入15mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液,然后准确加入5mL 5%固体曲浸出液,用水定容至刻度。

3.1.3 定糖:空白液测定:吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5mL,置于100-150mL三角瓶中,准确加入5mL空白液,并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液,使滴定时消耗的0.1%标准葡萄糖溶液在1mL以内,摇匀。于电炉上加热至沸腾,立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失,此滴定操作需在1min内完成。

糖化液测定:准确吸取5mL糖化液代替5mL空白液,其余操作同上。 3.1.4 结果计算

固体曲糖化酶活力定义:1g绝干固体曲,在30℃、pH4.6、1小时内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。

糖化酶活力(V0-V)C

501001

1000 55W

式中:V0——5mL空白液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积(mL)

V——5mL糖化液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积(mL) C——标准葡萄糖溶液浓度(g/mL)

50/5——5mL糖化液换算成50mL糖化液中的糖量(g) 100/5——5mL浸出液换算成100mL浸出液中的糖量(g) W——绝干曲称取量(5.0g) 1000——g换算成mg

3.2.淀粉酶活力测定 3.2.1 待测酶液的制备

精确称取酶粉2.0000g,先用少量的40℃0.02mol/L pH6.0的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲溶液溶解,并用玻璃棒捣研,将上层液小心倾入500mL 容量瓶中,沉渣部分再加入少量上述缓冲液,如此反复捣研3~4次,最后全部转入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度,摇匀,40℃浸取30min,然后,通过四层纱布过滤,滤液供测试用。

3.2.2 测定

取2mL终点标准指示液与白瓷板空穴内,作为颜色的标准。

取20mL2%可溶性淀粉溶液和5mL pH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液,注入150mL三角瓶中,在60℃恒温水浴中预热5min,然后加入预先稀释好的酶液0.5mL,立即记录时间,充分摇匀,定时用滴管取出反应也约0.5mL。滴于预选充满比色稀碘液(约1.5mL)的白瓷板空穴内,当空穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色,与标准终点指示颜色相同时,即为反应终点,记录时间T(min)。 3.2.3 结果计算

以1g酶粉(或1mL酶液)于60℃,pH6.0的条件下,1小时液化可溶性淀粉的克数来表示(g/g•h或g/mL•h)。

60

酶的活力单位202%n/0.5

T

式中 n------酶粉稀释倍数;

2%------淀粉溶液浓度;

20------可溶性淀粉吸取体积(mL); T------测定记录时间(min);

0.5-----测定时所用酶液体积(mL);

3.3 蛋白酶活力测定 3.3.1 标准曲线的绘制

L-酪氨酸标准溶液:按表1配制。L-酪氨酸稀释液应在稀释液应在稀释后立即进行测定。

表1

分别取上述溶液各1.00mL(须做平行试验),各加碳酸钠溶液5.00mL、福林试剂使用溶液1.00mL,振荡均匀,置于40±0.2℃水浴中显色20min,取出,用分光光度计于波长680nm,10mm比色皿,以不含酪氨酸的0管为空白,分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度c为横坐标,绘制标准曲线。 利用回归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug),即为吸光常数K值。其K值应在95-100范围内,如不符合,需重新配制试剂,进行试验。 3.3.2 待测酶液的制备

称取酶样品1-2g,精确至0.0002g。然后用相应的缓冲液溶解并稀释到一定的浓度,推荐浓度范围为酶活力10-15u/mL。

对于粉状的样品,可以用相应的缓冲液充分溶解,然后取滤液(慢速定性滤纸)稀释至适当浓度。 3.3.3 测定步骤

3.3.3.1 先将酪蛋白溶液放入40±0.2℃恒温水浴中,预热5min。 3.3.3.2 按下列程序操作:

试管A(空白) 试管B(酶试样) ↓ ↓

加酶液1.00mL 加酶液1.00mL ↓40±0.2℃,2min ↓40±0.2℃,2min 加三氯乙酸2.00mL(摇匀) 加酪蛋白溶液1.00mL(摇匀) ↓40±0.2℃,10min ↓40±0.2℃,10min 加酪蛋白溶液1.00mL(摇匀) 加三氯乙酸2.00mL(摇匀) ↓ ↓

取出静置10min,过滤(慢速定性滤纸) 取出静置10min,过滤(慢速定性滤纸)

↓ ↓

取1.00mL滤液 取1.00mL滤液 ↓ ↓

加碳酸钠溶液5.0mL 加碳酸钠溶液5.0mL ↓ ↓

加福林试剂使用溶液1.00mL 加福林试剂使用溶液1.00mL ↓40±0.2℃,显色20min ↓40±0.2℃,显色20min 于680nm波长,用10mm比色皿测定吸光度 于680nm波长,用10mm比色皿测定吸光度

3.3.3 结果计算

从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力,单位为u/mL。

XA1V14n11

m110

其中,X——样品酶活力,u/g

A1——由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力,u/mL V1——溶解样品所使用的容量瓶体积,单位为mL 4 ——反应试剂的总体积,单位为mL n1——样品的稀释倍数

m1——样品的质量,单位为克(g)

1

10

——反应时间10min,以1min计

所得结果表示至整数。

4 数据处理与分析

4.1固体曲糖化酶活力测定 4.1.1数据处理

表1 糖化酶活力测定实验滴定所用滴定液体积

组别 空白试样(ml)

样品试剂(ml)

1 9.76

2 9.70

3 10.12

平均值 9.86

5.45 5.38 5.38 5.41

由于V0=9.86,V=5.41,c=0.001 g/mL,W=5.0g,X=178 4.1.2 结果分析

实验结果表明试样蛋白酶活力为178,根据查找的资料可知本实验所用酶活力偏低。原因如下:

实验人员的在吸取、滴定等操作存在误差,导致实验结果有所偏差。 制备5%固体曲浸出液时,糖化酶没有完全浸出,造成分解淀粉量减少,滴定所用标准葡萄糖溶液增多,计算所得酶活力减少。

进行滴定时,本来是用5ml的糖化液进行滴定的,但由于滴定反应过程中生成黑色物质,导致观察不到反应终点。我们就减少了滴定量,改用0.5ml的糖化液进行滴定,能准确的观察到终点。

改用0.5ml的糖化液进行滴定,用所记录的标准葡萄糖溶液消耗的体积进行计算,虽推导出适合的公式,但还是会产生较大的误差。

4.2目视比色法测定淀粉酶活力 4.2.1数据处理

碘液变化颜色发生时间为:6min30s,即6.5min。

60

酶的活力单位202%n/0.5

T

60202%1/0.56.5

7u/ml 4.2.2 结果分析

实验结果表明试样淀粉酶活力为,根据查找的资料可知[2],该实验淀粉酶反

应的全部时间控制在2min-2.5min内,但我们实验所用时间远远超过这个范围,实验偏差较大。

可能造成的原因为:取出反应液与碘液反应时,由于取出反应液间隔时间太短,不能准时观察出反应终点,可能造成所记录时间是已过了反应终点的时间;通过观察液体颜色的变化来观测实验终点时,因为终点颜色较难精准确,可能会导致结果有一定偏差;由于实验条件的限制致使反应温度不能达到实验60℃的温度要求,较低的温度又影响了酶的活力使得反应时间较长,而在没有保温的情况下温度随着反应时间增长而下降,又进一步造成了酶活的下降,由此造成实验结果不够准确;淀粉酶活力测定的时候,只能用淀粉酶直接从淀粉的非还原性末端分解α-1,4-糖苷键,所以测得的淀粉酶活力可能会比实际酶活力低一些。

4.3福林酚法测定蛋白酶活力 4.3.1 数据处理

图1 酪氨酸标准曲线

样品测得吸光值为:0.750

即:0.750=0.011x+0.0095,算得A1=67.32μg/mL 代入公式:

X

A1V14n11

m110

=3366 u/g

4.3.2 结果分析

根据国标23527-2009可知酶制剂的酶活力应大于或等于50000µ/g[3],我们实验蛋白酶活力偏低。

在做空白实验过程中,因为人为原因加三氯乙酸终止反应时间过短,导致残留一部分酶液与酪蛋白反应。因此实验中测得的溶液的吸光度偏低。

实验所用酶液是从冰箱中取出,使用前没有充分升温使酶复活,酶液没有放于40℃水浴锅中保温,可能使酶没有充分复活,酶活力不高。

5 讨论

随着现代科学技术的发展酶的应用越来越广泛,酶的活力作为衡量酶质量的一个重要的指标,酶的活力是进一步研究与酶有关的问题的基础。酶活力的测定在生物化学实验中的重要性不言而喻。

酶活性的测定受多种因素的影响糖化酶实验的测定中,空白的选择,糖化时间长短、次碘酸钠法中试剂加入顺序、酶制备液存放时间长短等对实验结果有较大的影响;在淀粉酶活力测定中反应时间的选择与酶量的控制尤为重要;酶粉的均匀性、酶的溶解性、酶液的放置时间、反应时间和取量操作误差等对蛋白酶活力测定的影响是不容忽视的。

在酶活力测定过程中,为了减少误差,应该熟悉掌握操作过程,对温度严格控制,为了减少视觉误差造成的影响,还可进行实验预滴定。

范文四:酶活力的测定 投稿:万礏礐

实验26 过氧化氢酶活力的测定(必修)

[目的与原理]

掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法,并用此方法测定水产动物血清中过氧化氢酶的活力。

血清中的过氧化氢酶(CAT)分解H2O2的反应,可通过加入钼酸铵而迅速中止,剩余的H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物,在405nm处测定其生成量,即可计算出CAT的活力,CAT活力单位定义为:每1分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位(U)。 [试剂与器材] 试剂:

1、磷酸盐缓冲液(67mmol / l,pH=7.4):取Na2HP04 7.60g,KH2P041.82g,溶于1L蒸馏水中,调pH至7.4。

2、基质液(65μmol/ l, H2O2):取30% H2O2 3.69 ml加pH7.4磷酸盐缓冲液至500ml。 3、钼酸铵:称取[(NH4)6Mo7O24]20.2g溶于500ml蒸馏水中。 器材:

721分光光度计 , 0.5cm比色杯,恒温水箱(37℃±0.5℃),试管 16mm×100mm,移液管,吸耳球,可调微量进样器。 [实验步骤]

1、样品测定:基质液置于37℃水浴 5 min,然后按下列步骤操作 试剂 基质液 钼酸铵 缓冲液 血清

对照管 1.0ml 1.0ml — 0.2ml

标准管 1.0ml 1.0ml 0.2ml —

测定管 1.0ml — — 0.2ml

37℃水浴准确温育60s后,立即加入钼酸铵1.0ml摇匀,10min后于405nm以蒸馏水调零比色。记录各管吸光度值(A)

2、计算:

过氧化氢酶活力(U/ L)= [(A对-A测)/ A标] ×(65×1×1000/0.2 ×1000) = [(A对-A测)/ A标]×325

(式中65为标准管H2O2浓度,1为1.0ml H2O2体积,1000换算成1L血清,0.2为血清用量, 1000为μmol 换算成 mmol) [方法评估]

本实验采用分光光度法测定底物(H2O2)的减少量来评价过氧化氢酶活力。此法操作简便、准确,在实验时间(1小时)内显色稳定,适于科研和实验检验用。 [应用意义]

CAT具有重要的生理功能,细胞内与产生H2O2的需氧脱氢酶类(如氨基酸氧化酶等)同时存在,能将细胞代谢所产生的毒性物质H2O2迅速加以清除,从而共同保护血红蛋白、巯基酶、膜蛋白和解毒作用。此外,CAT清除H2O2后可减少过氧化脂质生成和对人体的毒害,因而有抗衰老和保护作用。 [注意事项]

1、反应时间在80秒内吸光度降低与反应时间成反比关系,故选用60秒为测定时间(所以本法不宜大批量样品同时测定,以每批4~5份为宜)。

2、酶活力在100~140U范围内呈线性关系;钼酸铵和H2O2呈色反应在pH<7时吸光度升高,当pH>7.6时吸光度下降,故选用pH7.4作为测定条件。

3、黄色复合物至少在1h内稳定。

4、血清不能溶血,溶血样品应该弃去。

5、加入钼酸铵后,由于释放O2,气泡会干扰比色,宜在显色10min后比色。 [思考题]

1、试述过氧化氢酶的测定方法?

2、底物与血液中过氧化氢酶反应时间为什么要准确定为60秒? 3、试述过氧化氢酶催化H2O2反应的机制?

淀粉酶活力的测定(必修)

[目的与原理]

掌握淀粉酶活力的测定方法,测定水产经济动物的主要消化器官肝胰脏、胃、肠内的淀粉酶活力。

淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键水解,产生葡萄糖、麦芽糖等。在基质充分的条件下,反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物,其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管比较其吸光度,从而推算出淀粉酶的活力单位。 [试剂与器材] 试剂:

1、0.04%可溶性淀粉

精确称取可溶性淀粉0.20g,置于20ml烧杯内,加入蒸馏水约5ml,摇匀使成淀粉混悬液,另称取无水磷酸二氢钠13.3g及苯甲酸4.3g,共置于500ml烧杯内,加入蒸馏水约250ml,煮沸后,将淀粉混悬液倒入此烧杯内,并用蒸馏水洗涤装淀粉混悬液的烧杯数次,洗涤亦倒入此烧杯内。继续煮沸1分钟,冷却至室温后倒入500ml容量瓶中,并用蒸馏水稀释至500ml刻度。此淀粉液pH应为7.0±0.1,在室温下保存2―3个月。

2、0.1N碘贮存液:精确称取碘酸钾(KIO3) 3.567g及碘化钾(KI)45g置于1L容量瓶内,加入蒸馏水约800ml,然后缓慢加入浓盐酸9ml,摇匀后用蒸馏水稀释至1L刻度,置冰箱内备用。

3、0.01N碘应用液:取0.1N碘贮存液50ml,用蒸馏水稀释至500ml,盛于棕色瓶中置冰箱内约保存1个月。 材料:

新鲜鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。 器材:

分光光度计、电子天平、离心机、pH测定仪,恒温水箱、匀浆器、剪子、镊子、冰块、50ml比色管若干、移液管若干,500ml容量瓶,烧杯。 [实验步骤]

1、 酶提取液的制备

取新鲜肝胰脏、胃、肠组织称重,在冰盘上剔除脂肪及内容物,以10倍缓冲液或去离子水匀浆各组织,将组织悬液低温下离心(3000rpm/min),上清液为酶粗提液(酶液)。

2、 (见实验蛋白酶活力的测定) 2、淀粉酶活力的测定

取50ml刻度比色管二只,标明为对照管,测定管。

0.04%可溶性淀粉

酶液 0.01N碘应用液

用蒸馏水稀释至50ml,立即混匀。用660nm或红色滤光板进行比色,以蒸馏水校正光密度0点,读取对照管和测定管光密度读数。

3、计算

淀粉酶活力单位定义:在370C、30min内,100ml酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10mg称为一个淀粉酶活力单位。

淀粉酶活力单位/100ml=(对照管光密度—测定管光密度)/对照管光密度×2/10×30/7.5×100/0.1=(对照管光密度—测定管光密度)/对照管光密度×800 [方法评估]

测定淀粉酶的方法有很多种,大致可分为两类:即测定底物(淀粉)的减少量和测定产物(如还原性糖)的生成量。本实验采用前者的淀粉—碘比色法。 [应用意义]

分析淀粉酶的活力有助于了解水产动物对食物中淀粉的消化能力,由于鱼虾等水产动物种类与大小的差异和所提供食物品质的不同,以及动物所处生活环境的变化,各种水产动物对食物的消化吸收有明显的差别。认识鱼虾消化酶变化特性,为研究水产种类饲料配伍提供科学依据 [注意事项]

1、0.04%可溶性淀粉溶液5ml内含淀粉量为2mg,在本法条件下,当2mg淀粉完全水解时相当于800淀粉酶单位/100ml(即:2/10 × 30/7.5 × 100/0.1 = 800)。

2、对照管内含淀粉2mg,由于淀粉溶液比较稳定,故对照管在固定比色计上的光密度读数并不改变,因而在测定中不必每次作对照管。

3、当淀粉酶接近800单位时,由于淀粉已几乎完全被水解,故加入碘液后也不再显蓝色,因此淀粉酶单位较高时(接近600单位)宜将标本稀释(2~5倍)后重新测定,并将测定结果乘以稀释倍数。

4、如淀粉溶液出现混浊或絮状物,表示淀粉溶液污染或变质,不能再用。

5、唾液内含有大量的淀粉酶,故即使是唾液的飞沫污染,也能使测定结果显著偏高。 [思考题]

1、试述淀粉—碘比色法测定淀粉酶活力的原理? 2、影响淀粉酶活力大小的因素有哪些?

对照管 5.0ml — 5.0ml

将两管在37℃水浴中预热2—5分钟

0.1ml 5.0ml

测定管混匀后,再置37℃水浴中反应7.5分钟

测定管 5.0ml

范文五:蛋白酶及其活力的测定 投稿:龙鎗鎘

第35卷第6期2008年11月

文章编号:1002-8110(2008)06-0100-03

酿酒

Vol.35.№.6Nov.,2008

LIQUORMAKING

蛋白酶及其活力的测定

张学英1,2

(1.湖南农业大学食品科技学院,长沙410128;2.湘西自治州产商品监督检验所,湖南

吉首416000)

摘要:蛋白质是生物生长繁殖氮源的重要来源,蛋白质为复杂大分子物质。蛋白质被蛋白酶在生化反应中水才可被机体吸收或被微生物利用。蛋白酶分解能力大小的指标是蛋白酶活力的大小。解为多种α-氨基酸等,

测定蛋白酶活力的大小是评判蛋白酶质量的关键,可用于指导生产(以酿酒生产为例)。同时通过控制蛋白酶活力的影响因素,完善蛋白酶生化反应环境。关键词:蛋白质;蛋白酶;活力测定;影响因素中图分类号:TQ925.2;TS207.3

文献标识码:B

DeterminationofProteaseActivity

ZHANGXue-ying

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,Hunan,China;

2.InstituteofSupervisionandInspectionoftheGoodsProduction,XiangxiAutonomousPrefecture,Jishou,Hunan416000,China)Abstract:Proteinsarecomplexmacromoleculeswhicharethemajorsourcesoforganism'sgrowthandpropagation.Onlyaminoacidshydrolyzedbyproteaseinbiochemicalreactioncanbeabsorbedbyorganismorbeutilizedbymicroorganisms.Thepro-teaseactivityistheindicatorofproteasedigestion.Thedeterminationofproteaseactivityisthekeyeventofproteasequalitye-valuation,aswellastheproductionguidance.Throughcontrollingtheinfluencefactorsofproteaseactivity,thebiochemicalreac-tiveenvironmentcanbeoptimized.

Keywords:protein;protease;activitymeasurement;influencefactor1蛋白质

蛋白质是构成生物体的基本物质,所有的生物机体均含大米、小麦、玉米、高粱等中都含有有蛋白质。对于酿酒原料:蛋白质,其蛋白质含量见表1:

表1酿酒原料蛋白质含量表[1]

名称蛋白质含量/%名称蛋白质含量/%名称蛋白质含量/%

8.6红薯干5~6大米8.5玉米

9.6豌豆26.5小麦12.4高粱

现已经发现的酶有3000多种,得以应用的只有几百种,所以酶的应用大有潜力。可以广泛应用于食品保鲜、淀粉食蛋白质食品、果蔬、食品添加剂等。品、

蛋白酶是催化蛋白质水解成α-氨基酸的酶,蛋白酶性质差别较大,不同蛋白酶,有不同的活性中心基团如:丝氨酸、半胱氨酸、天门冬氨酸、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+等[4]。3酿酒中的蛋白酶

蛋白质是白酒生产中微生物生长繁殖氮源的重要来源,但蛋白质是结构极其复杂的大分子化合物,只有蛋白酶将其分解为氨基酸后方能被微生物利用,酿酒大曲中含有多种霉菌,其中米曲霉、白曲霉、黄曲霉等含有丰富的蛋白酶。与白酒生产有关的蛋白酶为酸性、中性及酸性-中性蛋白酶,分类如下:酸性蛋白酶:最适pH2~5,产该酶的微生物主要为米曲霉、黑曲霉、根霉等。中性蛋白酶:最适pH=7左右,4~50℃酶活力较高,由细菌、霉菌产生。酸性-中性蛋白酶:最适pH5~7,由曲霉产生。

在白酒酿造上,蛋白质对白酒的微生物的生长、发育和白酒的风味等方面起重要作用,如:高级醇是白酒香味的重要组成部分,它是由氨基酸经酵母分解脱氨基而生成的。此外,高级醛类、酮类等重要香味物质均由氨基酸转化而来[2]。生产中

蛋白质主要组成元素有:C、N、O、H、S、P、Cu、Mn、Zn、I等。蛋白质在一定条件下被蛋白酶水解成多种α-氨基酸的混合物,常见的有甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸等。蛋白质水解过程为:蛋白质→月示→胨→多肽→α-氨基酸的混合物。2生物酶及蛋白酶的应用

酶是生物催化剂,它不仅存在生物体内,而且也存在生物体外,只要条件适宜,都可以催化专一的生化反应。酶的催化作用具有专一、高效、反应条件温和等特点,并广泛应用于食品、食品添加剂、医药、轻工、化工、环保、能源等领域。在我国四千多年前,酶应用于酿酒、制酱、制饴等生产中。

收稿日期:2008-07-16

作者简介:张学英(1975-),女,湖南吉首人,大学本科,工程师,湖南农业大学食品科技学院在读研究生,发表论文数篇。

·100·

第六期张学英:蛋白酶及其活力的测定2008

合理添加蛋白酶可使基酒总酸、总酯增加,能显著降低杂醇油含量,改善风味,使发酵过程中蛋白质水解更彻底,有效提高原料利用率和产品质量[3]。4(蛋白)酶活力的定义

1961年国际生物化学联合会规定:在特定的条件下(温度pH等条件均采用最适条件),每可采用25℃或其它适用温度、

分钟催化1μmol底物转化为产物的酶量,定义为1个酶活力单位,酶的国际单位(unit)。酶活力的SI单位即开特(kat)定义:每秒钟催化转化1μmol底物所需的酶量(即1unit=16.67nkat)。

[4]

4.00、5.00、6.00mL各稀释10倍,得浓度分别为0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0μg/mL标准系列。5.5.5

样品及标准系列处理(列表)

样品及标准系列处理

标2标3标4标5标61.001.001.001.001.005.005.005.005.005.001.001.001.001.001.00

样11.005.001.00

样21.005.001.00

mL空白01.005.001.00

表2

标11.00各吸

0.4mol/LNa2CO35.00

1.00福林-酚试剂

5.6样品计算以1g绝干曲粉,在pH3溶液中,40℃每分钟水解酪蛋白生成酪氨酸微克数表示试样的蛋白质被分解情况:

蛋白酶分解力(酪氨酸.μg/g.min)=(c×4.00×n)(/mS×t)c:从标准曲线上由试样平均吸光度求得酪氨酸的浓度μg/mL

n:酶液稀释倍数(视具体情况而定)ms:试样以绝干物质计的质量10.0gt:酶水解时间10min4.00:酶水解液总体mL5.75.7.1

测定注意事项

缓冲液pH的配制必须准确(该法用pH3的缓冲液,因

5蛋白酶活力的测定5.1

原理

酪蛋白在一定pH与温度下,可被蛋白酶水解为含有酚基的酪氨酸,福林-酚试剂在碱性条件下,可被酚类化合物还原生成蓝色的钨蓝和钼蓝,其颜色深浅在一定浓度范围内与酚类化合物含量成正比,可在680nm波长下用比色法测定样品与空白试样的吸光度。最后利用最小二乘法求出回归方程。

[5]

5.25.35.45.4.15.4.25.4.35.4.4

蛋白酶活力的定义同上述酶活力的定义相同,底物为

酪蛋白被蛋白酶水解转化为酪氨酸。

仪器可见分光光度计、恒温水浴锅(35±0.2℃、40±试剂

福林-酚试剂:主要化学药品钨酸钠(Na2WO4.2H2O)0.4mol/LNa2CO30.4mol/LCCl3COOH0.05mol/L

缓冲液(CH2CHOHCOH-CH2CHOHCO2Na)

0.2℃)

检测对象不同,缓冲液pH不同),恒温水浴锅的温度应恒定,并且终止酶反应加入的CCl3COOH应相当迅速、及时、准确,以减少人为误差。5.7.2

酪蛋白的质量对测定结果影响较大,配制此标准液应保以防变质,保质期为3d。在配制标准溶液时,存于4℃冰箱中,

若泡沫过多,无法看清定容刻度时,可加入几滴酒精消泡[5]。5.7.3

结果报告单上应注明底物酪蛋白的生产厂名和牌号,

不同生产厂生产的酪素,用于测定结果会有差异,一般推荐上海乳品一厂生产的化学试剂,同时对不同生产厂的产品应进行对照试验[5]。结果报告时应注明测定条件如:pH、温度等。因为蛋白质分解力与测定温度、缓冲液pH、酶解时间、酶液用量等均有关系。5.7.4

由于试样(酿酒大曲)本身含有蛋白质及少量的氨基酸等,所以酪蛋白在保温无酶的作用下,也有少量的氨基酸,故必做空白试验,否则测定结果将会高于实际具体的蛋白酶分解力。5.7.5

常用终止酶反应的方法:①反应时间一到,立即取出适量反应液,置于沸水浴中,加热使酶失活。②加入适量酶变性剂如:三氯醋酸等,使酶变性失活。③立即加入酸或碱,使反应液pH迅速远离酶反应pH。④立即置于冰堆或冰盐溶液中,使反应温度迅速降低到10℃以下[4]。5.7.6

对于标准曲线的求证,应用二次回归方程,多点校正法。本人曾做过相关实验,求出回归方程y=0.0099x+0.0699r=0.9895具有很好的线性关系[6]。6影响(蛋白)酶活力的因素6.1

底物浓度

在一定底物浓度范围内,V反应与C底物成

正比关系,当底物浓度过高时,反应速度反而降低,是由于高C底物引起的抑制作用。

钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、H3PO4、HCl、硫酸锂(Li2SO4)。

pH=35.4.55.4.65.55.5.1

2%酪素溶液:酪蛋白配制

酪氨酸标准贮备溶液100μg/mL:用L-酪氨酸配制操作步骤

样品前处理(酶液的制备)称相当于10.0g绝干曲粉,

加入适量pH=3的缓冲液,使V总=100mL于烧怀中,烧怀放于35±0.2℃的恒温水浴锅中,保温1h(每15min搅拌一次),用干滤纸或脱脂棉过滤,去初滤液,根椐具体情况用pH=3的缓冲液进行稀释,以使吸光度的值在0.2~0.4之间为宜。5.5.2

酪蛋白的水解:先将适量的2%酪素液和制备好的酶

液放入40±0.2℃的恒温水浴锅中保温3~55min,然后吸2份保温后的酶液1.00mL(视具体情况而定),各加入保温后的酪素液1.00mL,摇匀,40±0.2℃恒温水浴中水解105min,立即加入0.4mol/LCCl3COOH液2.00mL,摇匀,使蛋白质沉淀,终止酶水解反应,并过滤备用。5.5.3

空白样

先加入2.00mL

0.4mol/L

CCl3COOH,再加

1.00mL酶制备液和1.00mL酪素液,40±0.2℃保温105min,过滤备用。5.5.4

标准曲线的制备

0、1.00、2.00、3.00、分别吸取100μg/mL的酪氨酸标液:

·101·

第35卷第6期2008年11月

文章编号:1002-8110(2008)06-0102-04

酿酒

Vol.35.№.6Nov.,2008

LIQUORMAKING

猕猴桃果酒酿造

罗登宏

(黄冈职业技术学院,湖北黄冈市4380002)

摘要:以猕猴桃为原料进行发酵酿酒实验,介绍了猕猴桃酒的生产工艺及其关键技术。以新鲜猕猴桃果实为原料,可获得色泽黄绿、果香浓郁、口味协调、酒体厚实的接种6.0%的活性干酵母,加白砂糖100g/L,在25℃下进行发酵,猕猴桃发酵酒,其酒精度为10.5%vol。所得猕猴桃发酵酒经蒸馏后得到无色透明,具有清爽果香味的猕猴桃白酒,其酒精度达到18%vol。然后,通过提取出茉莉花茶中的香味成分,加入到猕猴桃白酒中,使其具有特殊的茉莉花茶香味。

关键词:猕猴桃;发酵;猕猴桃酒中图分类号:TS262.7;TS261.4

文献标识码:B

KiwiFruitLiquorMaking

LUODeng-hong

(HuanggangVocationalandTechnicalCollege,Hubei438000,China)

Abstract:Brewingexperimentswerecarriedoutusingkiwiasrawmaterials.Theprocessandkeytechnologywereintroduced.Thefermentationwasperformedat25℃usingfreshkiwifruitasrawmaterialstogetherwith100g/Lsugar,inoculatedwith6.0%activedryyeast.Kiwiwine,withthegreencolor,fruitaromaenriched,tastecoordinationandbodythicknesscharacters,wasgained.Itsalcoholcontentwas10.5degree.Afterdistillation,thecolorless,transparent,witharefreshingscentofkiwifruitliquorwasobtained.Itsalcoholcontentreached18degree.Thearomaticingredientsextractedfromthejasmineteawereaddedtothekiwiliquor,whichprovideditsspecialflavorofjasminetea.Keywords:kiwi,fermentation,kiwiliquor

猕猴桃素有水果之王的美誉,营养丰富,它富含维生素C、维生素B类、钙、铁、磷、硒等人体所需的营养素。猕猴桃鲜果及其深加工产品,深受国内外消费者的青睐,猕猴桃果品中独特的香气成份和加工制成品中维生素C的高含量为一大

收稿日期:2008-06-10作者简介:罗登宏(1964-),男,湖北麻城人,副教授,主要从事高职食

特色。进入21世纪后,饮料酒消费方式的改变,人们追求天然、含糖量少有益于健康的果酒及果汁饮料,进一步促进了饮充分利用我国猕猴桃丰富资源料酒品种结构的改变[1]。因此,优势,生产果酒可促进经济发展。1材料与设备1.1

材料

品加工专业的教学研究和软饮料的研究。

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

6.2酶活力、酶量、酶类以及酶的浓度对测定的影响,而其中6.6各种酶共存的相互影响(即辅酶的影响)生化反应比

以蛋白酶类的性质为关键,不同成品曲蛋白酶分解力大小不同,一般为黄曲霉>白曲霉>黑曲霉。6.3

温度

每种酶都有不同的有效温度范围(可能进行催化

作用的温度)和最适温度(催化反应速度最大的温度),但酶是蛋白质,温度过高会失活,一般的酶在60℃以上都会变性失活,但也有例外,如α-淀粉酶。6.4

pH的影响

每种酶都有不同的有效pH范围和最适pH

条件,pH过高过低均能影响酶的活性,主要是由于pH改变酶分子及底物分子的解离状态。6.5

抑制或激活剂的影响

常见抑制剂:汞、银、铅等以及氰

化物、H2S等;激活剂有金属离子:Ca2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Mn2+等以及无机负离子如:Cl-等。·102·

较复杂,常伴有许多其它生化反应,各种酶的反应并非孤立作用。在白酒酿造中单有α-淀粉酶的存在,则饭粒的溶解非常迟缓,而酸性蛋白酶则对饭粒的溶解有极大的辅助作用。

[参考文献]

[1]钱松,薛惠茹.白酒风味化学[M].中国轻工业出版社出版,1997[2]李大和.浓香型曲酒生产技术[M].中国轻工业出版社出版,1997[3]武庆尉,等.合理使用酸性蛋白酶降低玉米普通白酒杂醇油含量[J]酿酒科技,2001(6)

[4]郭勇,郑穗平.酶在食品工业中的应用[M].中国轻工业出版社出版,1998

[5]蔡定域.实用白酒分析[M].成都科技大学出版社出版,1994[6]雷红松,张学英.标准曲线法在分析检测中的应用及讨论[J].酿酒科技,2007(10)

范文六:测定蛋白酶活力 投稿:叶泀況

一、实验目的

1.加深了解酶活力的概念。

2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。

二、实验原理

酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后,反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。

酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。

实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物,该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收,其吸光值与酪氨酸含量呈正比。

因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化,可计算出蛋白酶的活力。

三、仪器和试剂

仪器:

恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。

原料

枯草杆菌蛋白酶:称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉,用少量0.02mol/L,pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL,震荡15分钟,使充分溶解,干纱布过滤,取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。

试剂

1. Folin-酚试剂:

在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g,钼酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL,充分混匀后,微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g,蒸馏水50mL 和液溴数滴,摇匀后开口继续煮沸15min,以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL,过滤,溶液呈黄绿色,置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L),然后加水稀释至1mol/L,即可使用。

2. 0.2mol/L 盐酸溶液

3. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液

4. 0.55mol/L 碳酸钠溶液

5. 10%三氯乙酸溶液

6. 0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液:

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g,用水定容至100mL(A 液);称取磷酸二氢钠(Na2HPO4 .12H2O)3.12g,用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL,B 液16mL 混合后,得到0.2mol/LpH7.5磷酸缓冲液,可长期存放。临用时稀释10倍即可。

7. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL):称取12.5mg 以烘干至恒重的酪氨酸,用0.2mol/L 盐酸约30mL 溶解后,蒸馏水定容至250mL。

8. 酪蛋白溶液(0.5%):称取1.25g 酪蛋白,用0.04mol/L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解,再用0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液定容到250mL。

四、操作步骤

(一)酪氨酸标准曲线的制作

取6支试管(标号0,1~5),按顺序分别加入0.00,0.20,0.40,0.60,0.80和1.00mL 标准酪氨酸溶液,再用水补足到1.00mL,摇匀后各加入0.55mol/L 碳酸钠5.0mL,摇匀。依次加入Folin—酚试剂1.00mL,摇匀并计时,于30℃水浴锅中保温15min。然后680nm 处

测定吸光值(以0号管作对照)。以酪氨酸含量(μg)作横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

(二)酶活力测定

1.酶反应:取一支试管,加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液,于30℃水浴中预热5分钟,再加入1.0mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液,立即计时,水浴中准确保温10min,从水浴中取出后,立即加入2.0mL的10%三氯醋酸溶液,摇匀静置数分钟,干滤纸过滤,收集滤液(样品液)。另取一试管,先加入1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0mL 的10%三氯醋酸溶液,摇匀,放置数分钟,再加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液,然后于30℃水浴保温10min,同样干滤纸过滤,收集滤液(对照液)。

以上两过程,应各做一次平行实验。

2.滤液中酪氨酸含量的测定

取3支试管,分别加入1.0mL 水、A 液、B 液,然后各加入5.0 mL 0.55mol/L 碳酸钠溶液和1.00mLFolin-酚试剂,摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值,由标准曲线查出A、B 液中酪氨酸含量差值,即可推算出酶的活力单位。

五、计算

A 样品—样品液的吸光度值

A 对照—对照液的吸光度值

K—标准曲线上A=1时对应的酪氨酸μg 数

V—酶促反应液的体积(本实验为5mL)

T—酶促反应时间(本实验为10min)

N—酶溶液稀释倍数

范文七:淀粉酶活力的测定 投稿:苏傣傤

芽孢杆菌产淀粉酶活力测定

一、实验目的

1、掌握分离淀粉酶的方法;

2、掌握测定酶活力的方法;

3、培养自行设计、实施实验的能力

二、实验原理

淀粉酶能水解淀粉中-1,4葡萄糖苷键,水解淀粉为分子量不一的糊精,淀粉迅速被液化。使淀粉与碘呈蓝紫色特征反应逐渐消,以该颜色的消失速度计算酶的活力的高低。

三 试剂和仪器

碘液 2%可溶性淀粉溶液 0.1mol/L三氯乙酸 离心机 分光光度计

四 实验步骤

1 、发酵培养

从斜面培养基上挑选生长状况良好的菌株在无菌操作下转移到发酵培养基上进行发酵。发酵的条件为37摄氏度,200r/min摇床培养过夜,24h.。

2、酶的提取

将发酵液8000r/min离心10min,取上清液测酶活,每个样品重复3次,最后结果取平均值。

3 酶活的测定

取5mL0.5%的可溶性淀粉溶液,在40℃水浴中预热10分钟,然

后加适当稀释的酶液0.5mL,反应5分钟后,用5mL0.1mol/L三氯乙酸终止反应。取0.5mL反应液与5mL碘液显色,在620nm处测光吸收值。以0.5mL水代替0.5mL反应液为空白,以同等浓度的双糖溶液(加同样体积的缓冲液)的管为对照。

4 酶活力的计算

酶活力根据下式计算:

酶活力(u/mL)=(R-r)*50*D

R

式中R、r分别表示对照和反应液的光吸收值,D为酶的稀释倍数。调整D使(R-r)/R在0.2—0.7之间。

确定在40℃5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位。

范文八:酶活力的测定国标 投稿:洪粘粙

木瓜蛋白酶活力的测定

一、试剂与溶液

1. 三氯乙酸

称取三氯乙酸6.54g,用水溶解并定容至100mL。 2. L-酪氨酸标准储备溶液(100μg/mL)

精确称取L-酪氨酸0.1000g,用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL,即为1mg/mL酪氨酸溶液。

吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL,用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL,即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。 3. 氢氧化钠溶液(20g/L)

称取氢氧化钠2g,加水搅拌溶解。待溶液到室温后 ,以水定容至100mL,搅拌均匀。 4. 盐酸溶液

1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液,加水定容至250ml。 0.1mol/L:取1.8ml的浓盐酸溶液,加水定容至200ml。 5. 酪蛋白溶液(10.0g/L)

称取标准酪蛋白1g,用少量氢氧化钠溶液润湿,加入相应的缓冲溶液约80mL,在沸水浴中100℃加热回流30min。冷却到室温后转入100mL容量瓶中,用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为3d。使用前重新确认并调整pH至规定值。

二、 分析步骤

1. 标准曲线的绘制

L-酪氨酸标准溶液:按表1配制。L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。

表1 L-酪氨酸标准溶液

分别取上述所配的溶液,以0管为空白,利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度c为横坐标,绘制标准曲线。利用回归方程,计算出吸光度为1时的酪氨酸的量(μg),即为吸光常数K值。其K值应在130~135范围内,如不符合,需重新配制试剂,进行实验。 2. 样品的测定

待测酶液的制备:称取酶样品1g。然后用磷酸缓冲溶液充分溶解,定容至50ml。

测定:先将酪蛋白溶液置于(40±0.2)℃恒温水浴中,预热5min,

然后按以下流程操作:试管A(空白)

↓ 加酶液2.00mL

↓(40±0.2)℃,2min 加三氯乙酸4.00mL(摇匀) ↓(40±0.2)℃,10min 加酪蛋白溶液2.00mL(摇匀)↓

取出静止10min,过滤 (慢速定性滤纸) 定容至100ml

↓ 测滤液吸光度

试管B(酶试样,需三个平行样)

↓ 加酶液2.00mL

↓(40±0.2)℃,2min 加酪蛋白溶液2.00mL(摇匀) ↓(40±0.2)℃,10min 加三氯乙酸4.00mL(摇匀)

取出静止10min,过滤 (慢速定性滤纸) 定容至100ml

↓ 测滤液吸光度

三、计算过程

从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力,单位为u/mL。样品的酶活力按下式计算:

X2= (X1×V×n×8)/(2×m ×10) 式(1) 式(1)中:

X1—由标准曲线所得的样品最终稀释液的酶活力,u/mL; X2—样品的酶活力,u/g;

V—溶解样品所使用量瓶的体积,mL; n—稀释倍数;

8—反应试剂的总体积,mL; 2—吸取酶液的体积,mL; m—样品的质量,g;

1/10—反应时间10min,以1min计。

1、标线的绘制

∵吸光度A=1时的酪氨酸的量(μg),即为吸光常数K值

∴求得

K=134.0135

2、样品的测定

范文九:蛋白酶活力的测定 投稿:邓舮舯

1 蛋白酶活力的测定

1.1 原理

采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物),由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等),可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物,在一定pH值和温度条件下,同酶液反应,经一段时间后终止酶促反应,经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液,用Na2CO3碱化,再加入福林-酚试剂显色,蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定,从而计算出蛋白酶的活力。

1.2 试剂

1.2.l 福林-酚试剂

向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水,再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL,充分混合后,接上回流冷凝管,以文火回流10h,结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水,再继续沸腾15min,以驱除过量的溴,冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色,需再重复滴加溴水的步骤),加去离子水定容至1000mL乱,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中,贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。

1.2.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液 精确称取TCA65.4g,加去离子水定容至1000mL。

1.2.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液 精确称取无水碳酸钠42.4g,加去离于水溶解后,定容至1000mL。

1.2.4 pH值3~6醋酸缓冲液

精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合,用去离子水稀释定容至1000mL。

1.2.5 2%酪蛋白底物缓冲液

1.2.5.1 测试酸性蛋白酶缓冲液

精确称取酪蛋白20g,加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制),在水浴中加热溶解,然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。当日配用或置于冰箱中保存。

1.2.5.2 测试中性蛋白酶缓冲液 精确称取酪蛋白20g,置于1000mL三角瓶中,加入0.2mol/L

Na2HPO4溶液(去离子水配制)610mL,在沸水浴中搅拌使其溶解,冷却后过滤,加入0.2mol/L

Na2HPO4溶液(去离子水配制)390mL,用去离子水定容至1000mL,即成pH7.0、2%酪蛋白溶液。当天配用或置于冰箱中保存。

1.2.6 100μg/mL酪氨酸溶液

精确称取100mg酪氨酸,逐步加入0.lmol/L盐酸溶解后,用去离于水定容至100mL放入冰箱中保存,临用时用去离子水稀释10倍。

1.3 操作步骤

1.3.1 酪氨酸标准曲线的绘制

取18支试管分成6组(每组3支,平行样),编号,按表1分别加入标准酪氨酸、去离子水、0.4mol/L的碳酸钠和福林-酚试剂,混匀后,放入40℃水浴保温20min,然后在721型分光光度计上进行比色创定(波长66Onm),以浓度为Oμg/mL酪氨酸反位液做空白对照。

' 1.3.2 样品酶活的测定

精确称取酶粉5g,充分碾细,加去离子水100mL,在40℃水浴中搅拌30min,充分溶出酶蛋白,然后过滤,留滤液待测。取4支试管编号(1号为空白对照),分别加入酶液1mL,1号管立即加入0.4mol/L

TCA溶液2mL,使酶失活,另3支样品加入lmL pH

7.0、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物缓冲液),迅速混匀,并立即放入40℃恒温水浴准确计时,保温1Omin后,立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL,终止反应,同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓冲液,摇匀,继续置于水浴中保温2Omin,取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物,然后取各试管滤液1mL,分别移入另4支试管中,再加入0.4mol/L碳酸钠溶液5nL和己稀释的福林-酚试剂1mL,摇匀,保温显色20min后,进行比色测定(波长66Onm)。对照标准曲线,计算酪氨酸含量。

管号 标准酪氨酸 去离子水 Na2CO3 福林一酚试剂 酪氨酸含量

(100μg/mL)(mL) (mL) (0.4mol/L)(mL) (mL) (μg/mL)

1 0 1.0 5 1 0

2 0.2 0.8 5 1 20

3 0.4 0.6 5 1 40

4 0.6 0.4 5 1 60

5 0.8 0.2 5 1 80

6 1.0 0 5 1 100

1.4 蛋白酶活力计算

蛋白酶活力,Ax4xN/l0。

式中:A:对照标准曲线得出的酪氨酸释放量;4:4机反应液取出1mL;N:酶粉的稀释倍数;10:反应时间1Omin;蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH3.6或7.0)和40℃温度条件下,每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。

范文十:淀粉酶活力测定 投稿:贾抰抱

a-淀粉酶活力的测定

赵婷,金颖,苍海燕,王新,王杰,李林,程世豪 (延边大学农学院食品科学系 09级一班二组)

摘要:研究淀粉酶的活力。以可溶性淀粉为原料,通过Wohlgemuth改良法测定α-淀

粉酶活力。在温度60℃,pH为6.0,常压下利用一定量酶的时候,根据反应进行到一定颜

色时所需要的时间求得酶的活力。通过实验验证在记录时间为s时达到反应终点,计算得酶活力单位为4232.804,方差为374.137。从而了解到实验中温度和时间控制对酶活力的影响。 关键词:a-淀粉酶;活力;可溶性淀粉;测定

Abstract:Of amylase. Soluble starch, modified by Wohlgemuth Determination of α-amylase activity. Temperature 60 ℃, pH 6.0, atmospheric pressure when using a certain amount of the enzyme, according to a certain color when the reaction time needed to obtain the enzyme activity. In record time through the experiment reaches the reaction end point for the s, calculated in units of enzyme activity 4232.804, variance 374.137. To understand the temperature and time control experiments on the enzyme activities.

Keywords: a-amylase; activity; soluble starch; determination

淀粉酶属于水解酶的一种,是淀粉水解的生物催化剂。按降解方式分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶和环湖精生成酶。α-淀粉酶将淀粉长链分子水解成短链分子时,以无规则的方式切断淀粉大分子内部α-1,4甙键而使淀粉生成糊精、低聚糖等,因产物的末端葡萄糖残基中C1碳原子为α-构形,故称为α-淀粉酶。大多α-淀粉酶(个别品种除外)不能切断α-1,6甙键,也不能切断分支点附近的α-1,4甙键,目前,α-淀粉酶在我国产量较大,广泛应用于食品、酿造、制药和纺织等领域。用α-淀粉酶水解淀粉时,要注意水解条件。影响α-淀粉酶活性的主要因素:pH值、温度和金属离子。

为了掌握淀粉酶糖化淀粉的原理、性质及作用;本实验通过Wohlgemuth改良法测定α-淀粉酶活力以熟练α-淀粉酶活力测定方法。

1材料与方法

1.1 材料

可溶性淀粉:四川省彭县军乐化工厂;

α-淀粉酶:活力>4000,北京奥博星生物技术责任有限公司。 1.2 试剂

结晶碘:天津市天大化工实验厂; 碘化钾:沈阳市华东试剂厂;

磷酸氢二钠:北京市北化精细化学品责任有限公司; 柠檬酸:天津市天大化工实验厂; 六水和氯化钴:国药集团化学有限公司; 重铬酸钾:天津市永大化学试剂开发中心; 络黑T:国药集团化学有限公司。 1.3 仪器

电子计时表、电子天平等。 1.4 设备

恒温水浴锅、冰箱等。 1.5器皿

白瓷板(或10 mL比色管)、微量移液管(1mL,5mL)、试管(25 mm×200 mm)、容量瓶100mL、250mL、500mL、1000mL 1.6方法 1.6.1试剂制备

a 原碘液 称取分析纯结晶碘ll g,分析纯碘化钾22 g,先用少量蒸馏水使碘完全溶解后,用蒸馏水定容至500 mL,贮于棕色瓶内。

b稀碘液 取原碘液2 mL,加碘化钾20 g,加蒸馏水溶解定容至500 mL,贮于棕色瓶内。

c 2%可溶性淀粉 称取2.00 g可溶性淀粉(以干物计),用少量蒸馏水调匀,徐徐倾入煮沸的蒸馏水中,加热煮沸至透明为止,冷却定容至100 mL。此溶液当天配制。

d 0.02 mol/L磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲溶液(pH6.0) 称取磷酸氢二钠(Na2HP04.12H20) 45.23 g和柠檬酸(C6H8O7.H20) 8.07 g,用蒸馏水溶解定容至1000 mL,配好后应以酸度计校正pH值为6.0。 e 标准终点色溶液

A液:称取分析纯氯化钴(CoCl2.6H20) 12.0732 g和分析纯重铬酸钾0.1463

g,以蒸馏水溶解定容至150 mL。

B液:称取络黑T(C20H12N3NaO7S) 8.0000 mg,以蒸馏水溶解定容至100 mL。 使用时取A液40 mL与B液5.0 mL混合。此混合液适宜冰箱保存,使用15天后需要重新配制。 1.6.2待测酶液的制备

称取酶粉1.0000~2.0000 g(或酶液1.00 mL),于50 mL的烧杯中,加入少量的40℃,0.02 mol的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲溶液(pH6.0)溶解,并用玻璃棒捣碎酶颗粒。在40℃恒温水浴锅中活化30 min,将上层清液小心地倾入250 mL容量瓶内,沉渣部分再加入少量上述缓冲溶液捣研,上清液倒入容量瓶,如此反复3~4次。用缓冲液定容至刻度,摇匀,通过4层纱布过滤,再用滤纸滤清,滤液供测定用。

1.6.3标准色的准备

取2 mL标准终点色移入比色管或白瓷板空穴内,作为比较颜色的标准。

1.6.4指标测定

(1)a-淀粉酶活力测定:Wohlgemuth改良法。

取2%可溶性淀粉20 mL和pH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲溶液5 mL于25 mm ×200 mm试管中,在60℃恒温水浴中预热4~5 min。然后加入预先稀释好的酶液0.5 mL,立即记录时间,充分摇匀,在30s、60s、90s、120s、180、210s定时用吸管取出反应液0.5 mL,滴于预先充满比色稀碘液(约1.5mL)的比色管或者白瓷板空穴内。当颜色反应由紫色逐渐变为红棕色,与标准终点色相同时,即为反应终点,并记录时间(s)。

2 结果及分析

2.1 在温度60℃,pH为6.0,常压条件下通过Wohlgemuth改良法测得每次α-淀粉酶反应其活力的最佳时间列表如表I,并计算得标准差为374.137。

表I

重复数

反应时间(min)

酶活力(g/ mL·min)

Ⅰ Ⅱ

2.5 3

4761.905 3968.254

Ⅲ 平均值

3 2.833

3968.254 4232.804

2.2可溶性淀粉被α-淀粉酶水解颜色变化效果测定结果如图I

图I

由图可以看出在30s和60s时颜色很深,酶的活性很小,从90s开始溶液颜色与对比试管中溶液颜色逐渐靠近,直到180s时颜色基本相同。

3 结论

本次实验我了解到影响酶活力的主要因素有温度、pH值及反应时间。在试验过程中因为第一次没在加入酶液后立即计时导致第一次取液加碘颜色与终点颜色极其相近,虽然是一次失败的实验,但了解到了时间对其影响的重要性,而且温度也必须保证在酶的最适温度才能表现出最佳效果。

参考文献

[1] Gardner H W.Recent investigations into the lipoxygenase pathway of plants.Biochem Biophysical Acta.1991

[2] 莎娜,赵立超,陈永泉.α-淀粉酶对甘薯果脯废糖液澄清效果的研究 [3] 何国庆,丁立孝.食品酶学.北京:化学工业出版社2009 [4] 周晓云编著.酶技术.北京:石油工业出版社,1995 [5] 罗贵民.酶工程.北京:化学工业出版社,2003 [6] http://zhidao.baidu.com/question/266186296.html

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